[發明專利]慢性青光眼動物模型建立方法及其應用

在審

• 申請號: 201810253148.4
• 申請日: 2018-03-26
• 公開（公告）號: CN108210520A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 吳仁毅;黃昌泉;汪耀;呂潔璇;李曉紅
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬廈門眼科中心有限公司
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;C12N5/079;A61K49/00;A01K67/02
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 彭志成

本發明公開的慢性青光眼動物模型建立方法，包括步驟：（1）取GFP?SD大鼠的結膜組織，滅菌，消化，分離結膜上皮層，得到結膜基質組織塊；（2）結膜基質組織塊胰酶中消化，用細胞培養液終止消化，吹打成單細胞懸濁液，經細胞篩，離心處理，棄掉上清液，得到結膜基質細胞沉淀；（3）加入適量的細胞培養液，吹打成單細胞后進行計數，體外培養，得到數量可觀的結膜基質細胞；（4）結膜基質細胞用胰酶消化后，用步驟（2）的方法處理得到結膜基質細胞沉淀，加入適量的細胞培養液得到細胞懸濁液；（5）將10 ul 細胞懸濁液用微量注射器注入大鼠右眼前房內并充分混勻。該方法得到的青光眼動物模型具有長期穩定、簡便易行、重復性好、成本低的優點。

技術領域

本發明涉及一種慢性青光眼動物模型建立方法及其應用。

背景技術

青光眼是以視神經萎縮、視野缺損及視力下降為共同特征的一組疾病，病理性眼壓增高、視神經供血不足是其發病的原發危險因素，視神經對壓力損害的耐受性也與青光眼的發生和發展有關。截至2010年，全球約有3千萬青光眼患者，40歲以上人群患病率為3.5%（[1] Glaucoma(2017).The Lancet.2017;390:2183-2193）。青光眼是全球三大致盲疾病之一，嚴重影響人民的生活質量。

青光眼動物模型對于更好的理解青光眼性視神經病變的損傷機制及治療措施有著重要的作用。目前慢性青光眼的動物模型主要有眼鞏膜表面房水靜脈注射高滲鹽水法、激光誘導法、鞏膜上靜脈燒灼法、前方注射聚苯乙烯微球等方法（[2]Rodent models ofglaucoma(2010).Brain Research Bulletin.2010;81:349-358）。雖然這些方法在建模初期均能使得實驗動物眼內壓的增高，但這些慢性青光眼動物模型的建立大多需要較高的技術條件，甚至維持動物高眼內壓的時間相對比較短暫。

有鑒于此，本發明人深入青光眼模型的研究工作，提出一種持續時間長、成本更低的慢性青光眼模型的建立方法，本案由此產生。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種長期穩定、簡便易行、重復性好、成本低的慢性青光眼動物模型建立方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

慢性青光眼動物模型建立方法，包括以下步驟：

（1）取GFP-SD大鼠的結膜組織，滅菌；將結膜組織放入分散酶或IV型膠原酶消化液中，并置于細胞培養箱消化，分離棄掉結膜上皮層，得到結膜基質組織塊；

（2）將前述結膜基質組織塊放入胰酶中消化，用細胞培養液終止消化，并吹打成單細胞懸濁液；單細胞懸濁液經70um孔徑大小的細胞篩后于離心機中離心處理，棄掉上清液，得到結膜基質細胞沉淀；

（3）在前述結膜基質細胞沉淀中加入適量的細胞培養液，吹打成單細胞后進行計數，將單細胞以一定密度種植于培養皿中進行體外培養，得到數量可觀的結膜基質細胞；

（4）經步驟（3）體外培養得到的結膜基質細胞用胰酶消化后，用步驟（2）的方法處理得到結膜基質細胞沉淀，加入適量的細胞培養液得到細胞懸濁液，細胞計數，使得最終細胞密度為1 × 10⁷ 個/ml；

（5）在麻醉下將10 ul 步驟（4）得到的細胞懸濁液用微量注射器注入大鼠右眼前房內并充分混勻，使其均勻分布于前房，左眼不處理作為正常對照眼球。

優選的，所述結膜組織需用滅菌PBS洗2遍。

優選的，所述結膜組織的消化條件為：放入中性蛋白酶或IV型膠原酶消化液中并置于37°C細胞培養箱中消化2小時或4°C過夜。

優選的，步驟（2）中，結膜基質組織塊放入胰酶中消化時間為10 min。

優選的，所述離心處理的條件為：4°C離心機中1500rpm離心5min。