[發(fā)明專利]慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810253148.4
• 申請(qǐng)日: 2018-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108210520A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳仁毅;黃昌泉;汪耀;呂潔璇;李曉紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)附屬?gòu)B門眼科中心有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/30
• 分類號(hào): A61K35/30;C12N5/079;A61K49/00;A01K67/02
• 代理公司: 廈門市新華專利商標(biāo)代理有限公司 35203
• 代理人: 彭志成

1.慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）取GFP-SD大鼠的結(jié)膜組織，滅菌；將結(jié)膜組織放入分散酶或IV型膠原酶消化液中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱消化，分離棄掉結(jié)膜上皮層，得到結(jié)膜基質(zhì)組織塊；

（2）將前述結(jié)膜基質(zhì)組織塊放入胰酶中消化，用細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，并吹打成單細(xì)胞懸濁液；單細(xì)胞懸濁液經(jīng)70um孔徑大小的細(xì)胞篩，后于離心機(jī)中離心處理，棄掉上清液，得到結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞沉淀；

（3）在前述結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將單細(xì)胞以一定密度種植于培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外培養(yǎng)，得到數(shù)量可觀的結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞；

（4）經(jīng)體外培養(yǎng)得到的結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞用胰酶消化后，用步驟（2）的方法處理得到結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞沉淀，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液得到細(xì)胞懸濁液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，使得最終細(xì)胞密度為1 ×10⁷ 個(gè)/ml；

（5）在麻醉下將10 ul 步驟（4）得到的細(xì)胞懸濁液用微量注射器注入大鼠右眼前房?jī)?nèi)并充分混勻，使其均勻分布于前房，左眼不處理作為正常對(duì)照眼球。

2.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：步驟（1）中，所述結(jié)膜組織需用滅菌PBS洗2遍。

3.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：所述結(jié)膜組織的消化條件為：放入中性蛋白酶或IV型膠原酶消化液中并置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2小時(shí)或4°C過(guò)夜。

4.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：步驟（2）中，結(jié)膜基質(zhì)組織塊放入胰酶中消化時(shí)間為10 min。

5.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：所述離心處理的條件為：4°C離心機(jī)中1500rpm離心5min。

6.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：步驟（2）和（3）的細(xì)胞培養(yǎng)液均采用含10% FBS、1% 鏈霉素、1% 青霉素的DMEM培養(yǎng)液。

7.如權(quán)利要求1所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法，其特征在于：所述體外培養(yǎng)包括：以3-5× 10⁵ 個(gè)/ml種植于直徑為100mm的培養(yǎng)皿中，每隔一天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)。

8.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的慢性青光眼動(dòng)物模型建立方法在慢性青光眼的模擬和防治中的應(yīng)用。