[發明專利]檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法、引物及試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201810247557.3
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108456741A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 盧迎春;賈兵;張廣輝;陳軍文;楊生超;宋婉玲;朱書生;朱有勇;陳中堅;魏富剛;張強皓;韋海南
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

本發明涉及檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法、引物、試劑盒及應用，屬于生物檢測技術領域。本發明采用的是核酸體外快速擴增與熒光檢測技術融合的新型技術，通過針對目的片段設計6條特異引物，使用有特殊活性的新型DNA聚合酶，通過擴增曲線實時監控整個等溫擴增核酸復制的反應過程，對產物做溶解曲線分析。本發明建立檢測三七成分環介導等溫擴增方法，可對待檢土壤中是否含有三七進行DNA層面的快速定性檢測，大大縮減了檢測使用時間，實現了三七策成分的快速檢測，無需核酸提取，土壤樣本簡單裂解后即可上機實驗，6條引物對應目標序列8個特異區域的識別保證了檢測反應的高度特異性，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法、引物及試劑盒及應用，用以預防三七連作障礙。

背景技術

三七為五加科人參屬植物，與人參同科同屬。研究表明，三七中數種皂苷等活性物質高于人參，對防治心腦血管疾病有顯著作用，尤其是在降血脂、降血糖、降血稠、降血壓、抗炎癥、抗疲勞和提高機體免疫力等方面療效顯著，而且安全無毒，從而給三七的開發應用展示出新的廣闊天地。

三七對種植環境要求極為苛刻，需生長在海拔1200-1500米，且光、熱、水、土、氣等條件都適宜方可。全國95%以上的三七產集中在文山，故云南文山又被稱為“三七之鄉”。

隨著百姓生活水平和保健意識的提高，三七市場不斷走俏，日常食用之外，三七在藥品、保健品、功能食品、化妝品等領域的深加工產業也日趨成熟，產量逐漸供不應求。

三七為宿根植物，忌地性極強，有嚴重的連作障礙，種過一茬之后，土壤成分會有顯著的結構性變化。隨著三七種植年限的增加，土壤pH呈顯著下降趨勢，土壤酸化現象加重；種植三七的土壤與未種植過三七的土壤相比有機質含量下降80%左右，并伴隨著土壤的板結；與生土和健康土相比，大量元素氮(N)和磷(P)含量在種植三七的土壤及發病土壤中顯著下降，鐵(Fe)、硼(B)、鋁(Al)等元素在種植三七的土壤中卻顯著升高；種植三七3年的土壤與生土相比，Fe、B、Al分別上升29%、31%、32%，土壤蛋白酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶及脲酶活性含量較生土下降50-90%不等。綜上所述，如繼續連作則會造成植物大面積死亡甚至絕收，對農戶及其他大規模種植造成不可估量的損失。

檢測未知土壤是否種過三七對于大規模產業化種植尤為必要，傳統方法需將土樣送至實驗室進行綜合成分鑒定，費時費力不易操作且周期長。研究表明，種植過三七的土壤中含有部分殘存根系，如能對土壤中殘存根系的DNA進行快速現場定性檢測，在極短的時間內檢出土壤中是否有三七特異DNA存在，用以鑒定土地是否近年來種植過三七，對于大規模種植前的土質檢測有非常重要的應用意義。

環介島等溫擴增技術（LAMP）是新型分子診斷技術，其反應過程在恒溫條件下進行，通過添加有特殊鏈置換活性的DNA聚合酶和針對目標基因特異性片段設計的引物組使核酸在恒溫條件下完成，有快速，靈敏和特異的優點。實時熒光法與LAMP技術相結合的檢測方式則使得檢測更加準確和直觀，核酸復制擴增反應結束后可對產物做退火溶解曲線分析，溶解曲線可進一步堅定該核酸擴增產物是否是特異性擴增。近年來被越來越多的實驗者應用到實際檢測中，準確、高效、簡單、快速、特異，非常適合土壤中三七殘留的快速檢測。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供了一種檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法、引物及試劑盒及應用，該方法可應用于現場的快速、準確、靈敏、操作簡單的檢測土壤樣本中是否含有三七的分子生物學方法，可用于避免因三七連作造成的經濟損失。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增引物，包括外部引物對、內部引物對和環引物對；

所述的外部引物對的序列為：