[發明專利]檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法、引物及試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201810247557.3
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108456741A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 盧迎春;賈兵;張廣輝;陳軍文;楊生超;宋婉玲;朱書生;朱有勇;陳中堅;魏富剛;張強皓;韋海南
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

1.檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增引物，其特征在于，包括外部引物對、內部引物對和環引物對；

所述的外部引物對的序列為：

上游外部引物F3：gtcaatcgttccgctgatat；

下游外部引物B3：gctggtactccagaagaga；

所述的內部引物對的序列為：

上游內部引物FIP：atgcagttacaaccgctgtgagaccatcgtgtgcttgaa；

下游內部引物BIP：cggcggtatgcttaggagatcgagttcatccatgcagtgat；

所述的環引物對的序列為：

上游環引物LF：gaaagctcttcgattgaaccg；

下游環引物LB：tttctttaataagctgcctgcg。

2.含有權利要求1所述擴增引物的檢測土壤中三七成分的試劑盒。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括：陽性對照模板、陰性對照模板、PCR反應液和裂解液；

所述的陽性對照模板為近兩年內種植過三七的土壤；

所述的陰性對照模板為未種植過三七的土壤。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的裂解液包括0.6M KOH溶液、質量濃度為1.5%的疏基乙醇溶液、1100mM Tris-Hcl緩沖液和質量濃度為0.5%不溶性聚乙烯吡咯烷酮懸浮液，體積比依次為1：1：2：2。

5.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，其擴增體系為：

模板 4μL，

上游外部引物F3 5uM 1μL，

下游外部引物B3 5uM 1μL，

上游內部引物FIP 40uM 1μL，

下游內部引物BIP 40uM 1μL，

上游環引物LF 20uM 1μL，

下游環引物LB 20uM 1μL，

PCR反應濃縮液 15ul，

總計25μL；

工作程序為：擴增程序：65℃擴增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃為一個循環。

6.權利要求1所述擴增引物在鑒別土壤是否能用于種植三七中的應用。

7.權利要求2-5任意一項所述試劑盒在鑒別土壤是否能用于種植三七中的應用。

8.檢測土壤中三七成分的環介導等溫擴增熒光檢測方法，其特征在于，分別以陽性對照模板、陰性對照模板、待檢測土壤DNA作為模板，采用權利要求2-5任意一項所述試劑盒或者權利要求1所述擴增引物進行環介導等溫擴增熒光檢測。