[發(fā)明專利]檢測土壤中三七成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測方法、引物及試劑盒及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810247557.3
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108456741A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧迎春;賈兵;張廣輝;陳軍文;楊生超;宋婉玲;朱書生;朱有勇;陳中堅(jiān);魏富剛;張強(qiáng)皓;韋海南
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

1.檢測土壤中三七成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其特征在于，包括外部引物對、內(nèi)部引物對和環(huán)引物對；

所述的外部引物對的序列為：

上游外部引物F3：gtcaatcgttccgctgatat；

下游外部引物B3：gctggtactccagaagaga；

所述的內(nèi)部引物對的序列為：

上游內(nèi)部引物FIP：atgcagttacaaccgctgtgagaccatcgtgtgcttgaa；

下游內(nèi)部引物BIP：cggcggtatgcttaggagatcgagttcatccatgcagtgat；

所述的環(huán)引物對的序列為：

上游環(huán)引物L(fēng)F：gaaagctcttcgattgaaccg；

下游環(huán)引物L(fēng)B：tttctttaataagctgcctgcg。

2.含有權(quán)利要求1所述擴(kuò)增引物的檢測土壤中三七成分的試劑盒。

3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括：陽性對照模板、陰性對照模板、PCR反應(yīng)液和裂解液；

所述的陽性對照模板為近兩年內(nèi)種植過三七的土壤；

所述的陰性對照模板為未種植過三七的土壤。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的裂解液包括0.6M KOH溶液、質(zhì)量濃度為1.5%的疏基乙醇溶液、1100mM Tris-Hcl緩沖液和質(zhì)量濃度為0.5%不溶性聚乙烯吡咯烷酮懸浮液，體積比依次為1：1：2：2。

5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，其擴(kuò)增體系為：

模板 4μL，

上游外部引物F3 5uM 1μL，

下游外部引物B3 5uM 1μL，

上游內(nèi)部引物FIP 40uM 1μL，

下游內(nèi)部引物BIP 40uM 1μL，

上游環(huán)引物L(fēng)F 20uM 1μL，

下游環(huán)引物L(fēng)B 20uM 1μL，

PCR反應(yīng)濃縮液 15ul，

總計(jì)25μL；

工作程序?yàn)椋簲U(kuò)增程序：65℃擴(kuò)增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃為一個(gè)循環(huán)。

6.權(quán)利要求1所述擴(kuò)增引物在鑒別土壤是否能用于種植三七中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求2-5任意一項(xiàng)所述試劑盒在鑒別土壤是否能用于種植三七中的應(yīng)用。

8.檢測土壤中三七成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測方法，其特征在于，分別以陽性對照模板、陰性對照模板、待檢測土壤DNA作為模板，采用權(quán)利要求2-5任意一項(xiàng)所述試劑盒或者權(quán)利要求1所述擴(kuò)增引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測。