[發明專利]用于檢測丁酰膽堿酯酶的熒光探針及其應用

有效

• 申請號: 201810247083.2
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN110294720B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 潘雪華
• 申請（專利權）人: 香港理工大學深圳研究院
• 主分類號: C07D277/66
• 分類號: C07D277/66;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 黃志云

本發明提供了一種用于檢測丁酰膽堿酯酶活性的熒光探針，所述熒光探針為非肽類熒光探針，且所述非肽類熒光探針的結構如下式1所示：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種用于檢測丁酰膽堿酯酶的熒光探針及其應用。

背景技術

丁酰膽堿酯酶(BChE)是存在于生物體內的一種乙酰膽堿同工酶，它是由肝臟合成的一種非特異性酯酶，由于該酶在肝臟中合成后立即釋放到血漿中，因此，血清中BChE活性是測定肝細胞蛋白質合成功能的靈敏指標。隨著檢測技術和臨床診療水平的不斷提高，丁酰膽堿酯酶除了用于評估肝臟儲備功能，還擴展到惡性腫瘤、神經系統性疾病、心血管疾病、代謝綜合癥等眾多疾病的檢測和診斷領域當中。現有測定丁酰膽堿酯酶活性的方法主要有兩種。第一種是毒劑和蛋白質加合物的分析檢測，主要是通過質譜分析手段來檢測神經性毒劑(GB,GD和VX)與血漿中的丁酰膽堿酯酶結合形成的加合產物來達到檢測目的。第二種方法則是氟離子重活化法，主要是神經性毒劑將丁酰膽堿酯酶磷酰化，再與氟離子作用后，神經性毒劑的磷酸基部分可以從膽堿醋酶中釋放出來，而再生的有機氟磷酸酯可以用GC、GC-MS等手段進行檢測，同時也可以利用大體積進樣技術來測定低濃度的再生有機氟磷酸酯。以上兩種方法不僅操作過程較為復雜，均需要昂貴的大型儀器與檢測費用才能實現，而且只能用于多肽類熒光探針的檢測。由于多肽類熒光探針存在穩定性差、儲運條件苛刻、原子利用率低、熒光強度弱等缺點，因此，設計開發基于非肽類的熒光探針及其檢測方法，顯得十分迫切和重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測丁酰膽堿酯酶的熒光探針及其應用，旨在解決本發明的目的在于克服現有技術中丁酰膽堿酯酶的檢測方法需要依賴昂貴的大型儀器設備、且檢測過程復雜的問題，而多肽類熒光探針存在穩定性差、儲運條件苛刻、原子利用率低、熒光強度弱的問題。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明一方面提供一種用于檢測丁酰膽堿酯酶活性的熒光探針，所述熒光探針為非肽類熒光探針，且所述非肽類熒光探針的結構如下式1所示：

本發明另一方面提供一種檢測丁酰膽堿酯酶活性的試劑盒，包括如上述非肽類熒光探針和丁酰膽堿酯酶的標準品。

本發明再一方面提供一種檢測丁酰膽堿酯酶活性的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

提供丁酰膽堿酯酶標準品、丁酰膽堿酯酶待測樣品和非肽類熒光探針；

將所述丁酰膽堿酯酶標準品和所述非肽類熒光探針混合反應，得到熒光團反應產物；檢測激發光刺激下的反應產物的熒光強度變化值隨時間的變化值，獲取丁酰膽堿酯酶-熒光強度變化值標準曲線，得到丁酰膽堿酯酶-熒光強度變化值線性方程；

在與所述丁酰膽堿酯酶標準品相同的檢測條件下，將所述丁酰膽堿酯酶待測樣品和所述非肽類熒光探針混合反應，得到熒光團反應產物；檢測激發光刺激下的反應產物的熒光強度變化值，代入所述丁酰膽堿酯酶-熒光強度變化值線性方程中，計算獲得所述丁酰膽堿酯酶待測樣品的濃度。

以及，本發明還提供一種非肽類熒光探針在丁酰膽堿酯酶檢測領域的應用，所述應用包括所述熒光探針用于檢測丁酰膽堿酯酶活性，所述熒光探針用于篩選丁酰膽堿酯酶抑制劑或促進劑，所述熒光探針用于丁酰膽堿酯酶抑制劑或促進劑的動力學表征領域的應用。

本發明提供的用于檢測丁酰膽堿酯酶活性的熒光探針為非肽類熒光探針，具有穩定性強、原子利用率高、熒光強度高、儲運條件靈活的特點。用于檢測丁酰膽堿酯酶活性時，丁酰膽堿酯酶待測樣品與所述非肽類熒光探針接觸后可產生熒光團(Fluorophore)，通過檢測熒光團在激發光下發出的熒光的強度，實現丁酰膽堿酯酶活性檢測的目的。與現有的多肽類底物熒光探針相比，本發明實施例提供的用于檢測丁酰膽堿酯酶活性的非肽類熒光探針具有專一性高和熒光強度變化顯著的優點，因此，與所述丁酰膽堿酯酶具有更好的親和力，檢測具有更高的靈敏度，從而能夠快速簡便、有效地檢測丁酰膽堿酯酶活性。