[發明專利]BTV-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT-PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201810246410.2
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108342510B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 聶福平;楊俊;王國民;王昱;黃秋華;李賢良
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 李金蓉

本發明公開了一種BTV?11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT?PCR試劑盒及其檢測方法，用于單管同時鑒別檢測藍舌病病毒11型、17型、20型、23型、24型。本方法根據各型病毒VP2基因序列保守區設計了5對PCR特異性引物，此外借鑒GeXP原理合成一對非生物來源的通用引物，在各對特異性引物的上下游分別添加通用引物構成5對特異性嵌合引物，用特異性引物進行反轉錄，最后采用通用引物及特異性嵌合引物構建多重PCR。利用優化的多重PCR體系及條件，可單管同時鑒別檢測這藍舌病病毒5種基因型中的一種或多種，對BTV其它型及PPRV、FMDV核酸無特異性擴增，最低檢測濃度可達到pg級。本發明方法靈敏度高、特異性強、節時省力并且易于觀察結果。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測方法及檢測試劑領域，PCR技術領域。具體而言，具體涉及藍舌病病毒(BTV)11型、17型、20型、23型、24型基因型多重RT-PCR檢測用試劑盒和檢測方法。

背景技術

藍舌病(Bluetongue，BT)是由呼腸孤病毒科環狀病毒屬成員藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，以昆蟲為傳播媒介的反芻動物的一種非接觸性傳染病，分布廣泛，除南極洲外的各個大洲都發生藍舌病的報道。BTV能感染大多數反芻動物，以綿羊最易感，且表現典型的臨床癥狀，牛及山羊多為隱性感染,沒有明顯癥狀，但可長期帶毒，野生動物及駱駝也可感染該病。由于病羊發病死亡，或即使不死，但其生產性能嚴重下降(如產肉產奶量下降，胎兒畸形、羊毛破壞、羔羊發育不良等)，造成巨大的經濟損失，且嚴重影響國際貿易，OIE將其列為法定通報疫病，我國將其列為一類動物傳染病。BTV血清型眾多，已經被證實的有27個，分別以BTV1-27命名，各血清型之間交叉保護性低，混合感染的情況也時常出現，故對病毒分型亦很有必要。目前適用的檢測方法主要有病毒分離培養、瓊脂糖免疫擴散試驗、血清中和試驗(VNT)、ELISA、抗原捕獲ELISA、RT-PCR、qRT-PCR及基因芯片技術。除VNT外均不能對病毒分型，而VNT雖能分型，但耗時長，成本過高，且對用于檢測的血清質量要求高，不適合常規檢測。國內外學者對病毒的分型做了相關研究，但只能單管對一型病毒分型，單管高通量對多型病毒分型的方法還未見報道。BTV-11/17/20/23/24已在多個國家被發現，BTV-11/17長期發生于美國，BTV-20、23多發于澳大利亞，BTV-20屬于澳大利亞的優勢血清型。在這五種血清型中，中國已有BTV-11、23、24發生。我國與世界各國有牛羊及其產品貿易，對藍舌病的檢測非常重要，以預防病毒傳入或傳出。

多重PCR是一種利用多條特異性引物在同一PCR反應體系中同時擴增出多個核酸片段的方法，具有操作簡單、快速、特異性好和敏感性高等有點。傳統多重PCR常常會存在引物之間相互競爭大而限制其通量和靈敏度的問題，Gexp-PCR用通用引物及上下游5’端分別帶有通用引物上下游的特異性嵌合引物來進行PCR擴增，在擴增時，通用引物結合在特異性嵌合引物的兩端，前幾輪由低濃度的特異性嵌合引物主導擴增，后面由高濃度的通用引物主導擴增，可以減小各特異引物間的競爭，增加單管PCR的檢測通量和檢測靈敏度。借鑒Gexp-PCR通用引物原理，但不像其在通用引物上添加熒光染料，使PCR產物不需要在專門的Gexp-PCR中才能分析，能在其它低成本儀器上分析，這樣的多重PCR既能增加單管檢測通量及靈敏度，又能減少成本。

發明內容

本發明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強、節時省力并且易于觀察結果的多重RT-PCR試劑盒和檢測方法，用于單管同時鑒別檢測藍舌病病毒(BTV)11型、17型、20型、23型、24型。

為了實現上述目的本發明采用如下技術方案：BTV-11型、17型、20型、23型、24型在同一RT-PCR反應體系中進行特異性擴增。

BTV-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別多重RT-PCR試劑盒，包括各型反轉錄引物管、Mix PCR反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管。

所述各型反轉錄引物管：