[發(fā)明專利]BTV-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT-PCR試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810246410.2
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108342510B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 聶福平;楊俊;王國民;王昱;黃秋華;李賢良
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 重慶市恒信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50102
• 代理人: 李金蓉

1.藍(lán)舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT-PCR試劑盒，其特征是：包括各型反轉(zhuǎn)錄引物管、Mix PCR反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管；

所述各型反轉(zhuǎn)錄引物管如下：

藍(lán)舌病病毒-11反轉(zhuǎn)錄引物管：DNA序列為SEQ ID NO.2 的藍(lán)舌病病毒-11下游引物0.5OD；

藍(lán)舌病病毒-17反轉(zhuǎn)錄引物管：DNA序列為SEQ ID NO.4 的藍(lán)舌病病毒-17下游引物0.5OD；

藍(lán)舌病病毒-20反轉(zhuǎn)錄引物管：DNA序列為SEQ ID NO.6 的藍(lán)舌病病毒-20下游引物0.5OD；

藍(lán)舌病病毒-23反轉(zhuǎn)錄引物管：DNA序列為SEQ ID NO.8 的藍(lán)舌病病毒-23下游引物0.5OD；

藍(lán)舌病病毒-24反轉(zhuǎn)錄引物管：DNA序列為SEQ ID NO.10的藍(lán)舌病病毒-24下游引物0.5OD；

所述Mix PCR反應(yīng)液管由以下反應(yīng)液組成：

DNA序列為SEQ ID NO.11的100μmol/L的通用上游引物0.75μL;

DNA序列為SEQ ID NO.12的100μmol/L的通用下游引物0.75μL;

DNA序列為SEQ ID NO.13的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-11特異性嵌合上游引物0.375μL;

DNA序列為SEQ ID NO.14的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-11特異性嵌合下游引物0.375μL;

DNA序列為SEQ ID NO.15的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-17特異性嵌合上游引物0.625μL;

DNA序列為SEQ ID NO.16的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-17特異性嵌合下游引物0.625μL;

DNA序列為SEQ ID NO.17的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-20特異性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列為SEQ ID NO.18的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-20特異性嵌合下游引物 0.25μL;

DNA序列為SEQ ID NO.19的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-23特異性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列為SEQ ID NO.20的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-23特異性嵌合下游引物0.25μL;

DNA序列為SEQ ID NO.21的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-20特異性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列為SEQ ID NO.22的10μmol/L的藍(lán)舌病病毒-20特異性嵌合下游引物0.25μL;

2X Premix Taq 緩沖液 12.5μL;

滅菌去離子水2.5μL;

合計20μL，為單次反應(yīng)的用量；

所述陽性對照管：管內(nèi)為藍(lán)舌病病毒-11、藍(lán)舌病病毒-17、藍(lán)舌病病毒-20、藍(lán)舌病病毒-21、藍(lán)舌病病毒-23陽性重組質(zhì)粒混合物；

所述陰性對照管：管內(nèi)為無藍(lán)舌病病毒-11、藍(lán)舌病病毒-17、藍(lán)舌病病毒-20、藍(lán)舌病病毒-23、藍(lán)舌病病毒-24的牛肉肌肉組織DNA樣品；

所述滅菌去離子水管：1000μL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述藍(lán)舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT-PCR試劑盒，其特征是：所述陽性重組質(zhì)粒由如下步驟獲得：分別以如下DNA序列引物組：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，按常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增，分別將PCR目的產(chǎn)物與PMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α后擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，并PCR鑒定、測序和NCBI-BLAST比對獲得。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述藍(lán)舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鑒別的多重RT-PCR試劑盒，其特征是：藍(lán)舌病病毒-11、藍(lán)舌病病毒-17、藍(lán)舌病病毒-20、藍(lán)舌病病毒-23、藍(lán)舌病病毒-24在同一PCR反應(yīng)管中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小，將這5種基因型進(jìn)行鑒別與區(qū)分。

4.利用權(quán)利要求1或2或3所述試劑盒進(jìn)行藍(lán)舌病病毒-11、藍(lán)舌病病毒-17、藍(lán)舌病病毒-20、藍(lán)舌病病毒-23、藍(lán)舌病病毒-24的多重RT-PCR非疾病診斷目的的檢測方法：包括如下步驟：

待測樣品cDNA模板制備：按照商品化病毒RNA提取試劑盒提取待測

樣品全基因組,分別用各型反轉(zhuǎn)錄引物及商品化反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書，制備待測樣品cDNA，取等量的待測樣品cDNA混勻置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：20μL Mix PCR反應(yīng)液,5μL待測樣品cDNA模板或陽性對照或陰性對照，反應(yīng)總體積為25μL;

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 30s，57℃退火30s，72℃ 30s，10個循環(huán)；95℃30s，50℃ 30s，72℃ 30S，25個循環(huán)；72℃ 5min，4℃保存；

結(jié)果判定：在Qesp100進(jìn)行毛細(xì)管電泳后，陽性對照出現(xiàn)5個吸收峰分別為藍(lán)舌病病毒-11在172-186bp間，藍(lán)舌病病毒-17在221-239bp之間，藍(lán)舌病病毒-20在317-343bp之間，藍(lán)舌病病毒-23在377-409bp之間，藍(lán)舌病病毒-24在266-288bp之間；陰性對照無吸收峰；樣品在陽性對照位置相同的位置出現(xiàn)吸收峰則判定為該基因型陽性，無吸收峰出現(xiàn)則判定為該基因型陰性；陽性質(zhì)控未出現(xiàn)目的條帶或陰性對照出現(xiàn)條帶，則結(jié)果無效。