[發明專利]一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法

有效

• 申請號: 201810246320.3
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108546683B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 陸杏蓉;梁賢威;龐春英;鄧廷賢;段安琴;馬小婭;梁莎莎
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水牛研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;C12N5/073
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韋玲雙

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法，其特征在于：具體步驟包括水牛卵母細胞體外培養；體外受精；單層共培養系統的制備；胚胎體外培養；腺病毒載體的包裝及腺病毒擴增；腺病毒滴度稀釋；腺病毒感染水牛顆粒細胞；腺病毒感染水牛胚胎，獲得腺病毒介導的水牛轉基因胚胎。本發明具有的優點是：采用本發明的技術方案將腺病毒介導感染水牛轉基因胚胎，水牛胚胎卵裂率、桑囊率、轉染囊胚率均有明顯的提高，能夠大大的提高轉染的效率。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法。

背景技術

動物轉基因技術自誕生之日起，就廣泛運用于畜禽生產性狀的改良、提高畜禽抗病力、非常規畜牧產品(如人藥用蛋白和工業用酶)的生產、人類疾病模型、生物反應器和生產人類器官等方面。然而，轉基因動物的低效率是制約該項技術發展的關鍵。傳統的轉基因胚胎生產方法一般為原核注射法、ICSI-Tr法、體細胞克隆法和腺病毒載體法。由于水牛受精卵內分布的脂肪滴較多，在顯微鏡下無法清晰地看到原核，且外源基因整合效率隨機不定，整體效率較低，因此不適宜采用原核注射技術生產轉基因水牛胚胎。相比較原核注射而言，ICSI-Tr注射針口徑較大，雖然對染色體的損傷較小，但是會損失較多的細胞質，且需要用到顯微操作系統，過程較繁瑣，效率較低。體細胞克隆轉基因法采用細胞導入法，雖然能較穩定將外源基因導入，但該法除了操作繁瑣效率低以外還需克服外源基因重組所帶來的異常表觀遺傳修飾模式。

本發明人在《中國畜牧獸醫》2016,43(10)：2661-2665中的《腺病毒載體轉染水牛不同原代體細胞的效果比較》疑問中就有關于腺病毒載體轉染水牛乳腺上皮細胞、卵丘細胞、成纖維細胞的研究；但是該項技術并沒有披露有關于用腺病毒載體轉染水牛胚胎的任何技術披露；傳統的腺病毒載體法只是籠統地將腺病毒感染受精卵，而未考慮到受精卵自身的特點和生長環境因素，因水牛胚胎體外生長需要顆粒細胞共培養，而且水牛受精卵內脂滴較多，透明帶較厚，一般的病毒難以攜帶外源基因高效通過，轉基因生產的效率較低；其次，在腺病毒感染水牛胚胎過程中將透明帶消化，降低了透明帶對外源物質進入胚胎的阻滯，本發明從共培養體系中的水牛顆粒細胞腺病毒感染著手，在不破壞水牛胚胎體外生產環境的前提下，對水牛胚胎進行腺病毒感染，以生產出轉基因胚胎為最終目標，提高轉基因胚胎的生產效率。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法，具體包括以下具體步驟：

(1)水牛卵母細胞體外培養：將屠宰場收集的水牛卵巢保存在39℃生理鹽水中于1～2小時內送到實驗室，去除卵巢系膜和輸卵管多余組織，接著使用含雙抗的生理鹽水清洗，清洗后抽取直徑為2～6mm的卵泡中的卵母細胞，然后選取胞質均勻、胞外有3層以上的顆粒細胞的水牛卵母細胞，洗滌后置于成熟培養液中于39℃、5％CO₂、飽和空氣濕度的培養箱中培養；

(2)體外受精：將水牛凍精解凍后在爬高液內培養30min，

將于成熟培養液中培養22～24h后的水牛卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞吹打掉后，置于受精盤微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；

將爬高培養后的精子經過洗滌后加入上述受精盤微滴中，控制精子濃度1×10⁶個/mL～1.5×10⁶個/mL，將受精盤置于39℃、5％CO₂、飽和空氣濕度的培養箱內培養；

(3)單層共培養系統的制備

將吹打掉的卵丘顆粒細胞吹打均勻后制成30μL/滴的微滴盤單層共培養系統，覆蓋石蠟油，于39℃、5％CO₂、飽和空氣濕度的培養箱內培養；