[發明專利]一種腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法

有效

• 申請號: 201810246320.3
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108546683B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 陸杏蓉;梁賢威;龐春英;鄧廷賢;段安琴;馬小婭;梁莎莎
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水牛研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;C12N5/073
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韋玲雙

1.腺病毒介導的高效生產水牛轉基因胚胎的方法，其特征在于：具體包括以下具體步驟：

（1）水牛卵母細胞體外培養：將屠宰場收集的水牛卵巢保存在39℃生理鹽水中于1～2小時內送到實驗室，去除卵巢系膜和輸卵管多余組織，接著使用含雙抗的生理鹽水清洗，清洗后抽取直徑為2～6mm的卵泡中的卵母細胞，然后選取胞質均勻、胞外有3層以上的顆粒細胞的水牛卵母細胞，洗滌后置于成熟培養液中于39 ℃、5% CO₂、飽和空氣濕度的培養箱中培養；

（2）體外受精：

將水牛凍精解凍后在爬高液內培養30min，

將于成熟培養液中培養22～24h后的水牛卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞吹打掉后，置于受精盤微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；

將爬高培養后的 精子經過洗滌后加入上述受精盤微滴中，控制精子濃度1×10⁶個/mL～1.5×10⁶個/mL，將受精盤置于39 ℃、5% CO₂、飽和空氣濕度的培養箱內培養；

（3）單層共培養系統的制備：

將吹打掉的卵丘顆粒細胞吹打均勻后制成30μL/滴的微滴盤單層共培養系統，覆蓋石蠟油，于39 ℃、5% CO₂、飽和空氣濕度的培養箱內培養；

（4）胚胎體外培養：受精培養18h后將附著于受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培養液中清洗2～3遍后置于單層共培養系統中，于39 ℃、5% CO₂、飽和空氣濕度的培養箱內培養，記錄胚胎各個階段發育情況，將發育后待感染胚胎的透明帶部分消化后置于微滴盤單層共培養系統中繼續培養；

所述待感染胚胎的透明帶部分消化的操作方法如下：

將受精卵置于含3.3 mg/mL Pronase的CM液滴中，在顯微鏡下觀察胚胎消化全過程，并記錄視野范圍內第一個胚胎透明帶開始變形的時間，將這個時間定義為 First time，然后繼續消化反應，并記錄該胚胎透明帶消失的時間，將這個時間定義為 End time，經過 5 次重復試驗后計算出 First time和End time的平均時間；利用平均時間，將受精卵放入含有3.3 mg/mLPronase的CM液滴中開始消化，First time后開始觀察受精卵透明帶變形情況，當透明帶開始變形時立即把受精卵移到含10%FBS的CM培養液中終止消化，但仍然要繼續觀察受精卵的消化情況，直至透明帶變到最薄又不破的時候，轉移到含10%FBS的CM培養液中完全終止消化，在含10%FBS的CM培養液中洗2～3次后放入含10%FBS的CM培養液滴中，并在39 ℃、5% CO₂、飽和空氣濕度的培養箱中培養備下一步試驗用；其中整個消化處理時間不超過End time的平均時間；

（5）腺病毒載體的包裝及腺病毒擴增：

A、收集腺病毒上清：

將293細胞計數后按照70%的細胞密度接種于60 mm培養皿，按轉染試劑Lipofectamine^R3000說明書進行轉染，其中質粒按pBHGloxdelE13cre：pDC316-eGFP=2:1比例加入；期間添加培養液，轉染后第10天，90%的細胞變圓而且其中60%細胞脫離培養皿底部后，用細胞刮刀收集細胞，細胞經液氮、37℃水浴反復凍融4～5次后，離心并收集腺病毒上清；

B、腺病毒擴增：

準備密度為70%的100 mm培養皿的293細胞，加入以上收集的病毒上清，擴增腺病毒，再次重復步驟A的方法收集腺病毒上清，用于后續試驗或凍存于-80℃冰箱備用；

（6）腺病毒滴度稀釋：

取腺病毒擴增后的腺病毒上清滴度為1 GFU/mL的腺病毒液，分別用胚胎培養液TCM199+10%FBS進行10倍連續稀釋，獲得滴度分別為1 GFU/mL、1×10^-1 GFU/mL、1×10^-2 GFU/mL、1×10^-3 GFU/mL、1×10^-4 GFU/mL、1×10^-5 GFU/mL的病毒液，置于-80℃冰箱備用；

（7）腺病毒感染水牛顆粒細胞：

a、取1 GFU/mL、1×10^-1 GFU/mL、1×10^-2 GFU/mL、1×10^-3 GFU/mL、1×10^-4 GFU/mL、1×10^-5 GFU/mL 、0 GFU/mL 濃度的腺病毒液分別感染水牛顆粒細胞單層，分別感染24h、48h、72h后用倒置熒光顯微鏡觀察試驗結果，選擇最佳感染水牛顆粒細胞的濃度；

b、取最佳感染水牛顆粒細胞濃度的腺病毒液分別感染水牛顆粒細胞單層，分別感染24h、48h、72h、96h后用倒置熒光顯微鏡觀察試驗結果，選擇最佳感染水牛顆粒細胞的時間；

所述水牛顆粒細胞單層為在步驟（3）中單層共培養系統中培養成功的單層細胞；

（8）腺病毒感染水牛胚胎：

選擇步驟（7）中最佳濃度的腺病毒液與于步驟（4）的微滴盤單層共培養系統中培養的待感染胚胎于胚胎培養液感染獲得腺病毒介導的水牛轉基因胚胎，感染的時間長為步驟（7）中的最佳感染時間；

所述胚胎培養液為TCM199+10%FBS+0.1%～0.5%灰樹花多糖+0.01%～0.05%螺旋藻多糖。