[發明專利]一種小型魚類DNA無損傷提取方法及DNA提取液

在審

• 申請號: 201810244862.7
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108531473A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 封琦;唐晟凱;韓曉磊;顧偉;于正興;陳建寧;王建國;王權
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 龔擁軍

本發明公開一種小型魚類DNA無損傷提取方法及DNA提取液，該提取方法包括：1）用棉簽從魚體一側的腮蓋后緣向尾部刮取魚體表粘液；2）將棉簽浸沒于DNA提取液中，渦旋、靜置；3）將棉簽擰干，加入異丙醇，混勻后?80℃過夜處理或以液氮處理10min；4）樣品自然解凍，離心，棄上清，加入乙醇，再次離心，取沉淀干燥，即提取獲得基因組DNA；所述DNA提取液包括：20mL 1M Tris、5mL 0.5M EDTA、12.5mL 2M NaCl、57.5mL ddH₂O、5mL質量分數為10%的SDS；本發明可應用于小型魚類DNA的無損傷提取，操作簡便，檢測準確性高，對魚類產生的應激反應低，宜于推廣應用。

技術領域

本發明涉及一種基因組DNA提取方法，特別是一種一種小型魚類DNA無損傷提取方法及DNA提取液。

背景技術

隨著環境污染的日趨嚴重，造成魚類的生存空間和繁殖都遇到了巨大的問題，對魚類種植資源的遺傳選育已提上日程。對魚類進行人工遺傳選育是保持魚類種質資源的重要手段和途徑，分子遺傳育種通常要涉及到到魚類的非致命性取樣，目前通常采用麻醉剪尾鰭的方法。這種方法對魚類雖然不損害魚的生命，但是對魚類還是會造成一定的傷害，不利于魚類的生存。

鳑鲏是雜食性魚類，棲息在緩慢流動或靜止的水域，依靠淡水河蚌（無齒蚌屬：Anodonta）繁殖，活動范圍小，壽命短。廣泛分布于東亞、東南亞和歐洲。鳑鲏類魚有著極高的觀賞價值和藥用價值，因此被許多魚類飼養愛好者和醫藥學家的青睞。但隨著環境棲息地的破壞，對其種質資源的保護已提上日程。

文獻“一種魚類DNA的非損傷檢測方法”（宋君等，四川動物，2013）公開了一種利用鯽魚體表粘液提取基因組DNA的方法，但該方法僅適用于體表粘液豐富的大型魚類，其采用任何工具都可以提取到體表粘液；中國專利申請201310122540.2公開了一種從大鯢體表粘液中提取基因組DNA的方法、中國專利申請201510956095.9則公開了一種從黃鱔體表粘液提取基因組DNA的方法，然而這兩篇專利所適用的對象范圍均有其特殊性，大鯢身上的鱗片已經退化，直接暴露在外的皮膚中，有不少特殊的黏液腺，能分泌出大量的黏液，形成一個黏液層；黃鱔屬于無鱗魚類，其粘液腺更發達，因此兩者均不存在取樣難的問題。

而長度為2-5cm的小型魚類的體表分泌粘液較少，體表粘液的提取較為困難，并不適用于上述提取方法。而在斑馬魚等小型魚類模式動物研究中通常采用的剪尾鰭的方法，會對魚類造成較強的機械刺激和損傷，不利于后期保種及人工繁育。因此，在遺傳育種中無損傷提取小型魚類基因組DNA已成為本領域亟待解決的技術問題。

發明內容

針對上述問題，本發明提供一種DNA提取液及其應用，以實現對小型魚類的基因組DNA提取，本發明是這樣實現的：

一種小型魚類DNA無損傷提取方法，其具體步驟如下：

1、采集魚類體表粘液：

（1）雙手帶上一次性無菌醫用橡膠手套，取一個白色瓷盤，并在白色瓷盤上覆蓋保鮮膜，然后取魚放置在保鮮膜上；

（2）取一根棉簽，然后一只手的食指和中指分別按住魚的頭部和尾部進行動物保定，另一只手用棉簽按著魚體的側面刮取粘液；從魚體的腮蓋后緣向尾部刮取5-10次；

（3）步驟（2）粘液刮取完成后，將魚翻轉，按照步驟（2）的方法對魚體的另一側刮取粘液；

（4）刮取完成后，將棉簽放置在干凈的試管中密封保存，并將魚放回飼養；

2、基因組DNA提取：

（1）將DNA提取液預熱至55℃；

（2）在1.5mL離心管中加入400μLDNA提取液，將步驟1獲得的棉簽剪斷長柄，置于提取液中，渦旋10-15s, 室溫靜置15min;