[發明專利]基于PCR的無縫構建小RNA表達載體的方法

有效

• 申請號: 201810241433.4
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108251444B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 柳素玲;周磊;盛丹丹
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

本發明提供了一種基于PCR的無縫構建小RNA表達載體的方法。具體地，本發明的方法包括步驟：(1)提供目的載體和用于擴增的第一引物和第二引物，其中第一引物為正向引物而第二引物為反向引物，所述的目的載體是環化的載體；(2)以所述目的載體為模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下進行擴增反應，從而獲得擴增產物；(3)在無縫克隆重組酶作用下，對擴增產物進行環化反應，從而形成環化的表達載體，即為用于表達小RNA的表達載體。本發明的方法大大簡化shRNA、sgRNA和crRNA等常用小RNA表達載體克隆過程，節省實驗者的時間，降低勞動量，提高成功率，降低構建成本。

技術領域

本發明屬于生物學領域，具體涉及基于PCR的無縫構建小RNA表達載體的方法，尤其是一種基于低循環數聚合酶鏈式反應(PCR)和無縫克隆技術的快速構建shRNA、sgRNA和crRNA等小RNA表達載體的方法。

背景技術

傳統shRNA、sgRNA和crRNA載體構建方法主要是將退火后的雙鏈DNA片段通過T4DNA連接酶連入經過特定限制性內切酶線性化的載體中，涉及包括寡核苷酸鏈加磷酸基，寡核苷酸鏈退火，載體酶切，酶切產物電泳，回收酶切目的片段，測定回收DNA的濃度，T4連接酶連接，轉化大腸桿菌等多個步驟。

傳統構建方法具有一些明顯的有待改進的缺點。(1)傳統構建方法步驟繁多，費時費力；(2)T4DNA連接酶由于穩定性較差，連接反應一般置于16℃(非最適溫度)進行，因此需要連接較長時間，導致整個克隆過程十分漫長；(3)此方法必須合成全長的兩條DNA寡核苷酸，如果shRNA載體發夾結構中的莖較長(≥22堿基)，則需要合成的寡核苷酸鏈長度將會變得很長(≥60堿基)，合成長鏈的帶有莖環結構的寡核苷酸不僅容易出錯，而且價格昂貴；(4)長寡核苷酸鏈的退火過程不僅耗費時間長而且容易出現錯配或者單鏈自身退火形成發夾結構，導致克隆失敗或者效率低下。

綜上所述，目前本領域尚缺乏令人滿意的構建小RNA表達載體的方法。

因此，本領域迫切需要開發新的、快速、高效、簡便地構建小RNA表達載體的方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種新的、快速、高效、簡便地構建小RNA表達載體的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種構建用于表達小RNA的表達載體的方法，包括步驟：

(1)提供目的載體和用于擴增的第一引物和第二引物，其中第一引物為正向引物而第二引物為反向引物，所述的目的載體是環化的載體；

第一引物具有5'到3'如式(Ia)所示的結構，

U0-U1-U2-U3

式(Ia)

式中，

U0為無或選定長度的5'端的額外序列；

U1為小RNA的正義鏈全部或部分的序列(或小RNA的全部或部分編碼序列)；其中，U0與全部或部分U1共同構成同源互補區，所述同源互補區互補于下述的第二引物的5'端，并且所述同源互補區的長度為8-20nt；

U2為無或連接序列；和

U3為與目的載體結合的正向引物結合區序列；

第二引物具有5'到3'如式(Ib)所示的結構，

D0-D1-D2-D3

式(Ib)

式中，

D0為無或選定長度的5'端的額外序列；