[發明專利]基于PCR的無縫構建小RNA表達載體的方法

有效

• 申請號: 201810241433.4
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108251444B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 柳素玲;周磊;盛丹丹
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

1.一種構建用于表達小RNA的表達載體的方法，其特征在于，包括步驟：

(1) 提供目的載體和用于擴增的第一引物和第二引物，其中第一引物為正向引物而第二引物為反向引物，所述的目的載體是環化的載體，且所述的目的載體的長度為3-20kb；

第一引物具有5'到3'如式(Ia)所示的結構，

U0-U1-U2-U3

式(Ia)

式中，

U0為無或選定長度的5'端的額外序列，所述選定長度為1-30nt；

U1為小RNA的正義鏈全部或部分的序列，或小RNA的全部或部分編碼序列，U1的長度為20-30nt；其中，U0與全部或部分U1共同構成同源互補區，所述同源互補區互補于下述的第二引物的5'端，并且所述同源互補區的長度為8-20nt；

U2為無或連接序列，所述連接序列的長度為1-20nt；和

U3為與目的載體結合的正向引物結合區序列，U3的長度為12-35nt；

第二引物具有5'到3'如式(Ib)所示的結構，

D0-D1-D2-D3

式(Ib)

式中，

D0為無或選定長度的5'端的額外序列；

D1為小RNA的反義鏈全部或部分的序列，或小RNA的全部或部分編碼序列；其中，D0與全部或部分D1共同構成同源互補區，所述同源互補區互補于所述的第一引物的5'端，所述的同源互補區在所述第一引物上的互補區位于所述第一引物的U0和/或U1區域；并且所述同源互補區的長度為8-20nt；

D2為無或連接序列，所述連接序列的長度為1-20nt；和

D3為與目的載體結合的反向引物結合區，D3的長度為12-35nt；

并且，所述的正向引物結合區和反向引物結合區在所述目的載體上是鄰接的；

(2) 以所述目的載體為模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下進行低循環數擴增反應，從而獲得擴增產物；

其中，所述低循環數擴增反應條件為：預變性98℃，2分鐘；9-12個熱循環，熱循環條件為98℃，10秒，55℃，10秒，和72℃，40秒；以及72℃，3分鐘；

(3) 在無縫克隆重組酶作用下，在體外對擴增產物進行環化反應，從而形成環化的表達載體，即為用于表達小RNA的表達載體；和

(4) 將所述環化的表達載體導入到體外細胞，所述細胞為表達小RNA的目標細胞，從而在所述細胞中產生小RNA；

其中，在所述環化的表達載體中，所述小RNA的編碼序列位于啟動子的下游以及終止子的上游；

所述的小RNA選自下組：shRNA、sgRNA、crRNA、基于內源microRNA結構的shRNA(shRNAmir)。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源互補區的長度為9-15nt。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的啟動子為人U6啟動子(hU6)、小鼠U6啟動子(mU6)，人H1啟動子(hH1)及最小CMV啟動子(mCMV)。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，U0的長度為1-20nt。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，U2的長度為2-10nt。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，U3的長度為15-25nt。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的載體的長度為5kb-10bp。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟：將所述環化的表達載體轉化進入大腸桿菌感受態細胞中以獲得單克隆，從而進行測序驗證、保存、和提取質粒。