[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)奶牛卵裂球重構(gòu)胚胎的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810241051.1
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108424935A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張立蘋;林鄭云;鄭新民;畢延震;劉西梅;肖紅衛(wèi);華再東;華文君;曹輝
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N5/073
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)奶牛卵裂球重構(gòu)胚胎的制備方法，屬于胚胎學(xué)領(lǐng)域。本方法具體如下：1、制備體外成熟奶牛卵母細(xì)胞；2、解凍高產(chǎn)奶牛冷凍精子；3、制備32細(xì)胞期以上高產(chǎn)奶牛體外受精胚胎；4、采用piezo操作系統(tǒng)構(gòu)建高產(chǎn)奶牛胚胎卵裂球重構(gòu)胚胎；5、重構(gòu)胚胎體外培養(yǎng)。本發(fā)明通過使用piezo操作系統(tǒng)制備高產(chǎn)奶牛胚胎卵裂球重構(gòu)胚胎，取代現(xiàn)有技術(shù)中使用激光破膜儀或者斜口針制備重構(gòu)胚胎的步驟，piezo操作系統(tǒng)將電壓效應(yīng)產(chǎn)生的脈沖經(jīng)由顯微注射針頭直接作用于欲注射的細(xì)胞表面，大大減少了對胚胎的損傷，提高了重構(gòu)胚胎的存活率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于胚胎學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)奶牛卵裂球重構(gòu)胚胎的制備方法。

背景技術(shù)

應(yīng)用體外受精方法可充分利用屠宰場廢棄的卵巢和優(yōu)質(zhì)奶牛的冷凍精液進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn)，不僅成本低廉，而且效果穩(wěn)定，不需要對母牛進(jìn)行超數(shù)排卵及同期發(fā)情處理，大大減少工作量、降低生產(chǎn)成本，同時(shí)大幅度提高優(yōu)良種公畜的利用率，使優(yōu)良種公畜獲得大量的后代，從而擴(kuò)大其在畜群遺傳改良中的作用。

胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)是指將一個(gè)多細(xì)胞胚胎的卵裂球和細(xì)胞核，通過顯微操作技術(shù)和細(xì)胞融合的方法，移植到一個(gè)去核卵母細(xì)胞或去核受精卵中，構(gòu)成新胚胎，然后移植給受體，獲得與核供體胚胎基因型相同的后代的生物技術(shù)。通過胚胎克隆可大量擴(kuò)增遺傳性狀優(yōu)良的動(dòng)物，加速遺傳改良和育種進(jìn)程。以屠宰場廢棄的奶牛卵巢中的卵母細(xì)胞和高產(chǎn)奶牛體外受精胚胎卵裂球細(xì)胞為研究對象，通過顯微操作技術(shù)進(jìn)行胚胎克隆，制備高產(chǎn)奶牛卵裂球重構(gòu)胚胎，能夠提供大量的優(yōu)質(zhì)胚胎，為生產(chǎn)提供便利?，F(xiàn)有技術(shù)一般采用激光破膜儀或者斜口針制備重構(gòu)胚胎，這兩種方法在制備的過程中對細(xì)胞的損傷比較大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有常用的方法中出現(xiàn)的缺點(diǎn)，提供一種采用piezo操作系統(tǒng)制備高產(chǎn)奶牛胚胎卵裂球重構(gòu)胚胎的方法，減小操作過程中對細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞重構(gòu)的成功率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，提供一種高產(chǎn)奶牛卵裂球重構(gòu)胚胎的制備方法，包括以下步驟：

(1)、制備體外成熟奶牛卵母細(xì)胞：

a.將屠宰場采集的奶牛卵巢放入添加雙抗的25℃滅菌生理鹽水中恒溫保存7h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，依次用30℃、35℃無菌生理鹽水洗滌，分別洗滌2次后置39℃水浴鍋中備用，10毫升一次性注射器抽吸法獲取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)；

b.將撿取的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)用提前2h于39℃水浴鍋中預(yù)熱的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS緩沖液洗滌3次，再用提前2h于39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱的體外成熟培養(yǎng)液洗滌3次后置于CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，采用五孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度：100-150枚/500μL；培養(yǎng)條件39℃,5％CO₂，飽和濕度；培養(yǎng)時(shí)間22-24h；

體外成熟培養(yǎng)液配方：TCM-199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL雙抗(即100IU/mL)+10IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E₂)；

(2)、解凍高產(chǎn)奶牛冷凍精子：西蒙塔爾牛冷凍精液用BO液上浮法處理，奶牛冷凍精液購買于武漢市奶牛改良站，品種為西蒙塔爾奶牛；精子的處理方法：從液氮罐取細(xì)管凍精放入37℃水浴中30～40s快速解凍，用75％酒精消毒后剪開細(xì)管，將精子放入含有1mLBO液的離心管中，用移液槍輕輕吹打后，上下顛倒幾次，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置20-30min，使精子上浮，上浮后將上浮的精子離心處理，1500r/min，5min，用BO’液再次離心處理兩次，1500r/min，5min；

(3)、制備32細(xì)胞期及以上高產(chǎn)奶牛體外受精胚胎：

a.步驟(1)b體外成熟后的卵母細(xì)胞經(jīng)2％透明質(zhì)酸酶消化脫去卵丘細(xì)胞后置于體外受精液BO’中平衡30min；