[發明專利]一種高產奶牛卵裂球重構胚胎的制備方法

在審

• 申請號: 201810241051.1
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108424935A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 張立蘋;林鄭云;鄭新民;畢延震;劉西梅;肖紅衛;華再東;華文君;曹輝
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N5/073
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種高產奶牛卵裂球重構胚胎的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、制備體外成熟奶牛卵母細胞：

a.將屠宰場采集的奶牛卵巢放入添加雙抗的25℃滅菌生理鹽水中恒溫保存7h內帶回實驗室，依次用30℃、35℃無菌生理鹽水洗滌，分別洗滌2次后置39℃水浴鍋中備用，10毫升一次性注射器抽吸法獲取卵丘-卵母細胞復合體(COCs)；

b.將撿取的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)用提前2h于39℃水浴鍋中預熱的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS緩沖液洗滌3次，再用提前2h于39℃培養箱中預熱的體外成熟培養液洗滌3次后置于CO₂培養箱中進行體外成熟培養，采用五孔板培養，培養濃度：100-150枚/500μL；培養條件39℃,5％CO₂，飽和濕度；培養時間22-24h；

體外成熟培養液配方：TCM-199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL雙抗(即100IU/mL)+10IU/mL人絨毛膜促性腺激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E₂)；

(2)、解凍高產奶牛冷凍精子：西蒙塔爾牛冷凍精液用BO液上浮法處理，奶牛冷凍精液購買于武漢市奶牛改良站，品種為西蒙塔爾奶牛；精子的處理方法：從液氮罐取細管凍精放入37℃水浴中30～40s快速解凍，用75％酒精消毒后剪開細管，將精子放入含有1mLBO液的離心管中，用移液槍輕輕吹打后，上下顛倒幾次，置于二氧化碳培養箱中靜置20-30min，使精子上浮，上浮后將上浮的精子離心處理，1500r/min，5min，用BO’液再次離心處理兩次，1500r/min，5min；

(3)、制備32細胞期及以上高產奶牛體外受精胚胎：

a.步驟(1)b體外成熟后的卵母細胞經2％透明質酸酶消化脫去卵丘細胞后置于體外受精液BO’中平衡30min；

b.步驟(2)中處理好的精子加入含有步驟(3)a中卵母細胞的體外受精微滴中，精子的終濃度為3×10⁵個/mL；

c.體外受精6h后，用移液器輕輕吹打受精卵，除去浮在受精卵表面的精子，用提前2h于39℃培養箱中預熱的體外受精胚胎培養液洗滌三遍后置于培養液中進行培養；培養濃度：50μL的培養滴中培養10-15個受精卵；24h半量換液，5d后可獲得32細胞期或以上胚胎；

BO液的配方：6.55mg/mL氯化鈉+0.3mg/mL氯化鉀+0.249mg/mL氯化鈣+0.0497mg/mL氯化鎂+0.0869mg/mL磷酸二氫鈉+3.104mg/mL碳酸氫鈉+2.5mg/mL葡萄糖+0.055mg/mL丙酮酸鈉+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL硫酸鏈霉素；

BO’液的配方：BO液+5mM咖啡因+10mg/mL肝素鈉+3mg/mLBSA；

(4)、采用piezo操作系統構建高產奶牛胚胎卵裂球重構胚胎：

a.取發育至32細胞期以上體外受精胚胎用0.25％鏈霉蛋白酶消化透明帶，獲得單個卵裂球，轉移至含10％FBS的TCM-199操作滴中備用；

選用內徑40μm、外徑180μm的固定針從時針9點方向吸卵母細胞，并且使第一極體處在1-3點方向，選用內徑15-20μm的注射針從3點方向進針采用piezo操作系統，利用其電壓效應產生的脈沖經注射針頭作用于細胞表面，破透明帶和細胞膜，去除含有第一極體在內的遺傳物質；piezo去除第一極體參數：破透明帶3，破細胞膜1；將去掉第一極體的卵母細胞轉移至放置有卵裂球的操作微滴中備用；

胚胎重構時，選用內徑40μm、外徑180μm的固定針從時針9點方向吸卵母細胞，選用內徑15-20μm的注射針吸取其中一個卵裂球采用piezo操作系統破透明帶置于已經去除包含有第一極體及遺傳物質的卵母細胞透明帶下備用；

或者

a’.選用內徑40μm、外徑180μm的固定針從時針9點方向吸卵母細胞，并且使第一極體處在1-3點方向，選用內徑15-20μm的注射針從3點方向進針采用piezo操作系統，利用其電壓效應產生的脈沖經注射針頭作用于細胞表面，破透明帶和細胞膜，去除含有第一極體在內的遺傳物質。piezo去除第一極體參數：破透明帶3，破細胞膜1；將去掉第一極體的卵母細胞轉移至放置有卵裂球的操作微滴中備用；取發育至32細胞期及以上體外受精胚胎轉移至含10％FBS的TCM-199操作滴中備用；

胚胎重構時，選用內徑40μm、外徑180μm的固定針吸取32細胞期及以上體外受精胚胎，選用內徑15-20μm的注射針利用piezo操作系統吸取其中一個卵裂球并將其置于已經去除包含有第一極體及遺傳物質的卵母細胞透明帶下備用；制備注射針的玻璃管購自于eppdorf公司，由發明人自己制備，注射針的針尖為平直的，針尖至針桿彎曲處的內針管內徑均為15-20微米，長度為6-10mm，針桿彎曲角度為150度；固定針的針尖為平直的，外徑180微米，內徑40微米，針桿彎曲角度為150度；

(5)、重構胚胎體外培養：

a.將制備的重構胚胎在融合液中洗滌3次后移入融合槽；

b.利用BTX-2001融合儀進行細胞融合，融合參數：110V 30μs 2DC；

c.融合后的胚胎用胚胎培養液CRlaa洗滌3次置入提前2小時平衡過的CRlaa培養基中培養，培養條件：39℃,5％CO₂，飽和濕度，24h半量換液，培養7d觀察囊胚發育率；

培養液CRlaa配方：114.7mM NaCl、3.1mM KCl、26.2mM NaHCO₃、0.4mM丙酮酸鈉、5.0mM乳酸半鈣、3mg/mL BSA、1.0Mm L-谷氨酰胺。