[發(fā)明專利]重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應用

在審

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• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108314709A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 王秀然;劉思陽;付玉芹;王巖;盧天成;李思圓;孫喆;李海燕;胡祥坤;王茗宇;鄭晗旭
• 申請（專利權）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C07K14/23
• 分類號: C07K14/23;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/31;C12N15/81;A61K39/39;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產(chǎn)權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

一種重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應用，涉及重組蛋白領域。本發(fā)明包括：對p39基因進行克隆，將PCR片段與克隆載體pMD?19T(Simple)相連，經(jīng)測序和酶切驗證正確后將目的片段與真核表達載體pPICZαA相連構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPICZαA?P39；電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pPICZαA?P39轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)誘導表達，親和層析純化，分子篩進一步分離純化后經(jīng)western blot驗證即為目的蛋白，最佳發(fā)酵條件為：pH6、磷酸鹽濃度0.02M、甲醇誘導濃度1％、誘導72h，純化后的重組蛋白P39濃度為5mg/ml。本發(fā)明為布魯氏菌流行性疾病免疫預防奠定基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及重組蛋白技術領域，具體涉及一種重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應用。

背景技術

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患的傳染病，在世界各地都廣泛流行，尤其是在發(fā)展中國家，目前，尚無有效的商品化人用疫苗，而動物疫苗多為弱毒苗，具有一定的毒性和致病力，難與自然感染區(qū)分開來，因此，研究有效的疫苗是控制動物布病的主要方法。目前，現(xiàn)有的有效布魯氏菌疫苗種類有死疫苗、減毒活疫苗等，減毒活疫苗免疫效果較好。現(xiàn)有的畜用減毒活疫苗有S19、Rev.1、RB51、S2和M5等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。國內(nèi)外現(xiàn)行布魯氏菌疫苗對牲畜的保護力一般是70～80％，因此，單依靠接種疫苗來消除布魯氏菌病是不實際的。牛用RB51粗糙型突變株疫苗開辟了布魯氏菌病防治的新領域，有效地提升了布魯氏菌病的防治效果，但在短時期內(nèi)就會在體內(nèi)中被清除。疫苗應用較為廣泛，在許多國家和地區(qū)將Rev-1疫苗免疫3-6個月齡的羔羊，他們認為Rev-1對羊有100％的保護性，接種過此疫苗的地區(qū)，人患布病發(fā)病率顯著減少，但是此疫苗對人有感染性，需要對獸醫(yī)人員要采取嚴格的保護措施。且減毒活疫苗存在毒力恢復以及隱性感染等危險外，而且會對當前廣泛采用的血清學診斷方法造成干擾，使得無法區(qū)分感染動物和免疫動物，對布病的徹底凈化根除造成了一定的干擾和困難。S19減毒株對牛和綿羊免疫效果好且效果穩(wěn)定，但對羊的免疫效力較差，對豬無效。另外，S19減毒疫苗有毒力返祖現(xiàn)象，會引起懷孕牛的流產(chǎn)。Rev.1和RB51都是突變株疫苗，應用較為廣泛，但是一旦突變株的疫苗毒力返強，后果將不堪設想。M5菌株被廣泛應用于羊布魯氏菌的預防，但該疫苗也會引起懷孕母畜的流產(chǎn)，且不利于鑒別診斷。

目前，科研工作者已經(jīng)開始利用基因工程和分子生物學手段對已知的免疫原性蛋白進行基因工程苗的研發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)一些保護性抗原分子有BCSP31、OMP25、L7/L12、P39、CuZn SOD及熱休克蛋白等。新型疫苗主要有DNA疫苗、重組蛋白疫苗和抗獨特型抗體疫苗等。DNA疫苗的研制獲已取得了一些成果，但由于其免疫保護性不高，目前還沒有DNA疫苗可以較好的保護動物免受致病株的攻擊。隨著牛種和羊種布魯氏菌全基因組測序的完成，科學家們對布魯氏菌各種基因的功能認識越來越透徹，研制基因缺失弱毒苗融合蛋白重組疫苗、以及蛋白修飾疫苗等新型布魯氏菌基因工程疫苗成為他們研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應用，為系統(tǒng)研究其作為一種新型的疫苗和免疫佐劑在布魯氏菌流行性疾病免疫治療中的作用奠定基礎。

本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發(fā)明的一種重組糖基化蛋白P39的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、真核表達載體pPICZαA-P39的構(gòu)建

對p39基因進行克隆，將PCR后的片段與克隆載體pMD-19T(Simple)相連，經(jīng)測序和酶切驗證正確后，將雙酶切后獲得的目的片段與同樣經(jīng)雙酶切的真核表達載體pPICZαA相連構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPICZαA-P39；

步驟二、P39蛋白在畢赤酵母GS115中的表達、純化及發(fā)酵