[發明專利]重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810239679.8
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108314709A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 王秀然;劉思陽;付玉芹;王巖;盧天成;李思圓;孫喆;李海燕;胡祥坤;王茗宇;鄭晗旭
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C07K14/23
• 分類號: C07K14/23;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/31;C12N15/81;A61K39/39;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

1.一種重組糖基化蛋白P39的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、真核表達載體pPICZαA-P39的構建

對p39基因進行克隆，將PCR后的片段與克隆載體pMD-19T(Simple)相連，經測序和酶切驗證正確后，將雙酶切后獲得的目的片段與同樣經雙酶切的真核表達載體pPICZαA相連構建重組表達質粒pPICZαA-P39；

步驟二、P39蛋白在畢赤酵母GS115中的表達、純化及發酵

利用電轉化法將構建好的真核表達載體pPICZαA-P39轉化至畢赤酵母GS115感受態細胞中，利用甲醇進行蛋白的誘導表達，應用親和層析方法對目的蛋白進行純化，并利用分子篩進一步分離純化目的蛋白，并利用westernblot對純化的蛋白進行驗證，通過優化單因素實驗得到最佳發酵條件為：pH值為6、磷酸鹽濃度為0.02M、甲醇誘導濃度為1％、誘導72h，純化后的重組蛋白P39濃度為5mg/ml。

2.根據權利要求1所述的重組糖基化蛋白P39的制備方法，其特征在于，步驟二中，真核表達載體pPICZαA-P39轉化至畢赤酵母GS115感受態細胞中的具體過程如下：

1、重組表達質粒pPICZαA-P39的提取

挑取培養的單個菌落接種于5mL LB液體培養基中，37℃，200rpm震蕩培養過夜后擴大培養過夜：

(1)收集40ml菌液放入50ml離心管中，10000rpm，離心3min，多收集幾次后，棄掉上清，倒置在濾紙上；

(2)向有沉淀的50ml離心管中加入10mlP1溶液，同時加入50ul TIANRED試劑，利用移液槍吹打混勻或用振蕩器混勻；

(3)向離心管中加入10mlP2溶液，溫和的上下翻轉6-8次，使菌體裂解，室溫放置5min；

(4)向離心管中加入10mlP4溶液，溫和的上下翻轉6-8次，至溶液出現白色分散絮狀沉淀，室溫放置10min，10000rpm離心5-10min；

(5)將全部溶液小心倒入過濾器中，過濾，自備50ml離心管；

(6)向濾液中加入0.35倍濾液體積的異丙醇，和1/2異丙醇體積的5M Nacl溶液，上下顛倒混勻；

(7)在4℃條件下，10000rpm離心30min，倒掉上清，將其倒置在濾紙上吸水；

(8)向管中加入6ml 70％的乙醇充分漂洗沉淀，4℃，10000rpm離心10min，倒掉上清，將其倒置在濾紙上；

(9)重復第7步；

(10)將離心管敞口放在室內10-20min，使乙醇揮發后加入1-1.5mlTB buffer溶解，Nano Drop檢測質粒濃度；

2、重組表達質粒pPICZαA-P39的線性化

將提取的重組表達質粒pPICZαA-P39利用SalI進行線性化，反應體系如下：質粒20μl、SalI限制性內切酶5μl、bufferH 5μl、ddH₂O 20μl，共20個樣品；37℃水浴3h；取5μl進行核酸電泳檢測酶切是否完全，未酶切質粒作對照；

3、醇沉淀法回收線性化的質粒

吸取酶切后的500ul質粒至1.5ml的離心管中，加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇，均勻混合，4℃條件下，12000rpm離心10min；取上層上清液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的5M Nacl溶液，-20℃條件下靜止2h；在4℃條件下，13000rpm離心10min，棄掉上清；用75％的乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min；自然晾干至乙醇完全揮發，10ul TB buffer回溶，沉淀即為線性化質粒，Nano Drop檢測核酸濃度；

4、電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞

取10ul經過SalI線性化后的質粒加入100ul的畢赤酵母GS115感受態細胞，混勻后加入0.1cm預冷的電擊杯中，冰浴5min，在電壓為1.8kV，電擊時間4-5ms的條件下進行電轉，電轉后加入1M山梨醇1ml，將其轉移至滅過菌的2ml離心管中，30℃，250rpm的條件下孵育2h；取200ul進行涂板，不同濃度的zeocin抗性平板。