[發(fā)明專利]重組糖基化蛋白P39及其制備方法和應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810239679.8 | 申請日： | 2018-03-22 |
| 公開（公告）號： | CN108314709A | 公開（公告）日： | 2018-07-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王秀然;劉思陽;付玉芹;王巖;盧天成;李思圓;孫喆;李海燕;胡祥坤;王茗宇;鄭晗旭 | 申請（專利權(quán)）人： | 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C07K14/23 | 分類號： | C07K14/23;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/31;C12N15/81;A61K39/39;A61K39/10;A61P31/04 |
| 代理公司： | 長春眾邦菁華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 22214 | 代理人： | 于曉慶 |
| 地址： | 130118 吉林省*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 質(zhì)粒pPICZ α A 制備方法和應(yīng)用 重組糖基化 重組蛋白 蛋白 驗(yàn)證 分子篩 親和層析純化 真核表達(dá)載體 重組表達(dá)質(zhì)粒 最佳發(fā)酵條件 流行性疾病 畢赤酵母 布魯氏菌 電轉(zhuǎn)化法 分離純化 甲醇誘導(dǎo) 克隆載體 免疫預(yù)防 目的蛋白 目的片段 誘導(dǎo)表達(dá) 磷酸鹽 測序 構(gòu)建 酶切 誘導(dǎo) 克隆 轉(zhuǎn)化 | ||
1.一種重組糖基化蛋白P39的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一、真核表達(dá)載體pPICZαA-P39的構(gòu)建
對p39基因進(jìn)行克隆，將PCR后的片段與克隆載體pMD-19T(Simple)相連，經(jīng)測序和酶切驗(yàn)證正確后，將雙酶切后獲得的目的片段與同樣經(jīng)雙酶切的真核表達(dá)載體pPICZαA相連構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-P39；
步驟二、P39蛋白在畢赤酵母GS115中的表達(dá)、純化及發(fā)酵
利用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pPICZαA-P39轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，利用甲醇進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用親和層析方法對目的蛋白進(jìn)行純化，并利用分子篩進(jìn)一步分離純化目的蛋白，并利用westernblot對純化的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，通過優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件為：pH值為6、磷酸鹽濃度為0.02M、甲醇誘導(dǎo)濃度為1％、誘導(dǎo)72h，純化后的重組蛋白P39濃度為5mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組糖基化蛋白P39的制備方法，其特征在于，步驟二中，真核表達(dá)載體pPICZαA-P39轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中的具體過程如下：
1、重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-P39的提取
挑取培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)過夜后擴(kuò)大培養(yǎng)過夜：
(1)收集40ml菌液放入50ml離心管中，10000rpm，離心3min，多收集幾次后，棄掉上清，倒置在濾紙上；
(2)向有沉淀的50ml離心管中加入10mlP1溶液，同時(shí)加入50ul TIANRED試劑，利用移液槍吹打混勻或用振蕩器混勻；
(3)向離心管中加入10mlP2溶液，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌體裂解，室溫放置5min；
(4)向離心管中加入10mlP4溶液，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀，室溫放置10min，10000rpm離心5-10min；
(5)將全部溶液小心倒入過濾器中，過濾，自備50ml離心管；
(6)向?yàn)V液中加入0.35倍濾液體積的異丙醇，和1/2異丙醇體積的5M Nacl溶液，上下顛倒混勻；
(7)在4℃條件下，10000rpm離心30min，倒掉上清，將其倒置在濾紙上吸水；
(8)向管中加入6ml 70％的乙醇充分漂洗沉淀，4℃，10000rpm離心10min，倒掉上清，將其倒置在濾紙上；
(9)重復(fù)第7步；
(10)將離心管敞口放在室內(nèi)10-20min，使乙醇揮發(fā)后加入1-1.5mlTB buffer溶解，Nano Drop檢測質(zhì)粒濃度；
2、重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-P39的線性化
將提取的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-P39利用SalI進(jìn)行線性化，反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒20μl、SalI限制性內(nèi)切酶5μl、bufferH 5μl、ddH2O 20μl，共20個(gè)樣品；37℃水浴3h；取5μl進(jìn)行核酸電泳檢測酶切是否完全，未酶切質(zhì)粒作對照；
3、醇沉淀法回收線性化的質(zhì)粒
吸取酶切后的500ul質(zhì)粒至1.5ml的離心管中，加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇，均勻混合，4℃條件下，12000rpm離心10min；取上層上清液，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的5M Nacl溶液，-20℃條件下靜止2h；在4℃條件下，13000rpm離心10min，棄掉上清；用75％的乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min；自然晾干至乙醇完全揮發(fā)，10ul TB buffer回溶，沉淀即為線性化質(zhì)粒，Nano Drop檢測核酸濃度；
4、電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞
取10ul經(jīng)過SalI線性化后的質(zhì)粒加入100ul的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，混勻后加入0.1cm預(yù)冷的電擊杯中，冰浴5min，在電壓為1.8kV，電擊時(shí)間4-5ms的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后加入1M山梨醇1ml，將其轉(zhuǎn)移至滅過菌的2ml離心管中，30℃，250rpm的條件下孵育2h；取200ul進(jìn)行涂板，不同濃度的zeocin抗性平板。
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