[發明專利]一種利用天然雙碳源高產N-乙酰神經氨酸的重組菌

有效

• 申請號: 201810239281.4
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108424868B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉延峰;王淼;張曉龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，利用天然雙碳源生產N-乙酰神經氨酸；所述天然雙碳源為葡萄糖和L-蘋果酸，在其基因組中以組成型強啟動子P₄₃過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，所述重組枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1為出發菌株，在基因組上將大腸桿菌來源的6-磷酸葡糖酸磷酸酶基因yqaB基因進行整合表達，并用組成型強啟動子P₄₃替換插入枯草芽孢桿菌谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶基因glms原始啟動子，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述6-磷酸葡糖酸磷酸酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，替換谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶的P₄₃啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO.4；還以pP43NMK表達N-乙酰氨基葡萄糖異構酶的編碼基因AGE和N-乙酰神經氨酸合酶的編碼基因NeuB。

2.構建權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶編碼基因pckA兩側同源臂基因、標記基因和P₄₃啟動子基因序列融合；

2)將上述重組整合片段轉化至枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB中。

3.一種生產N-乙酰神經氨酸的方法，其特征在于，應用權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌進行發酵。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，向含有葡萄糖和L-蘋果酸的培養基中接種所述重組枯草芽孢桿菌，于35～38℃下發酵30～50h。

5.權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌在生產或制備含N-乙酰神經氨酸的產品方面的應用。