[發明專利]一種利用天然雙碳源高產N-乙酰神經氨酸的重組菌

有效

• 申請號: 201810239281.4
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108424868B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉延峰;王淼;張曉龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種利用天然雙碳源高產N?乙酰神經氨酸的重組菌，屬于遺傳工程領域。本發明通過強啟動子P₄₃過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因PckA，利用葡萄糖、L?蘋果酸鈉天然雙碳源發酵，實現N?乙酰神經氨酸合成途徑中磷酸烯醇式丙酮酸的高效供給，以加強合成途徑，本發明的重組枯草芽孢桿菌與出發菌株相比，其N?乙酰神經氨酸產量從1.15g/L提高到1.65g/L，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產N?乙酰神經氨酸奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種利用天然雙碳源高產N-乙酰神經氨酸的重組菌，屬于遺傳工程領域。

背景技術

N-乙酰神經氨酸是生物體內重要的糖類物質，在生物體內負責信號傳遞等功能。在人體中，N-乙酰神經氨酸參與細胞間信號轉導、識別等重要生理過程。因此，N-乙酰神經氨酸被廣泛應用于流感抗炎，增強免疫力，促進適齡嬰兒大腦發育，以及維持老年人大腦功能和健康。目前，N-乙酰神經氨酸主要采用從蛋類、燕窩等含量相對豐富的天然材料中提取，得到的產品易引起過敏反應，或是通過化學法合成，高溫、高壓工藝復雜，且對環境污染嚴重，或是大腸桿菌全細胞催化反應獲得，存在底物轉化率低，產物不易分離等問題。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主，其被FDA認證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級別。因此，通過基因工程改造枯草芽孢桿菌，可以高效生產食品安全級N-乙酰神經氨酸。然而，枯草芽孢桿菌自身合成途徑代謝流通量不足，影響N-乙酰神經氨酸合成效率。如何強化枯草芽孢桿菌代謝流供給，實現N-乙酰神經氨酸合成前體的高效供給，對于N-乙酰神經氨酸的工業化生產具有重要意義。

發明內容

有報道表明，當底物存在葡萄糖的情況下，枯草芽孢桿菌可以同時、高效利用L-蘋果酸鈉，且L-蘋果酸鈉代謝主要流向Neu5Ac合成前體之一的磷酸烯醇式丙酮酸(Chubukov,V.et al.Transcriptional regulation is insufficient to explain substrate‐induced flux changes in Bacillus subtilis.Molecular systems biology 9,709(2013).)，據此，本發明利用枯草芽孢桿菌利用葡萄糖和L-蘋果酸鈉天然雙碳源的特性，進一步以強啟動子P₄₃過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA，強化L-蘋果酸鈉向磷酸烯醇式丙酮酸代謝流，以提高Neu5Ac合成效率。

本發明的第一個目的是提供一種高效利用天然雙碳源生產N-乙酰神經氨酸的重組枯草芽孢桿菌，所述天然雙碳源為葡萄糖和L-蘋果酸。

在本發明的一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌在基因組中以組成型強啟動子P₄₃過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckA。

在本發明的一種實施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔptaΔptsG::lox72；Δctc::p43-Gna1；ΔspsC::p43-yqaB；Δglms::p43-glms,pP43NMK-AGE-NeuB為宿主構建得到的。