[發明專利]高拷貝高表達重組質粒的構建及其在外源基因表達中的應用

有效

• 申請號: 201810235661.0
• 申請日: 2018-03-21
• 公開（公告）號: CN108823228B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發明（設計）人: 蔡春林;徐雪姣
• 申請（專利權）人: 安徽朵能生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12P21/00
• 代理公司: 合肥洪雷知識產權代理事務所(普通合伙) 34164
• 代理人: 孫小華

本發明公開了一種高拷貝高表達重組質粒的構建及其在外源基因表達中的應用，涉及基因工程技術領域。本發明以pcDNA3.1(?)質粒為骨架，將cumate?cymR誘導表達調控單元裝入pUC ori高拷貝復制子和Ampicillin抗性基因之間，同時將pET?28a T7啟動子下游的多克隆位點以及6xHis編碼序列和T7轉錄終止序列插入cumate?cymR調控單元的下游構建出高復制和高表達的重組質粒DN?001。本發明的重組質粒DN?001具有最經濟、最方便和高產量等優點，使得基因表達載體的重組省時、省力；可以適用于生產大劑量的重組蛋白；同時有效地抑制了漏出表達，使得這一載體特別適合有毒蛋白的表達，使得這一載體具有廣泛的市場前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種通過基因工程方法改造的高拷貝高表達重組質粒，及該重組質粒在外源基因表達中的應用。

背景技術

原核生物基因表達系統是最經濟、最方便和使用最廣泛的重組基因表達系統，包括His標簽重組蛋白的表達(現有文獻：Rosano GL,Ceccarelli EA.Recombinant proteinexpression in Escherichia coli:advances and challenges.FrontMicrobiol.2014Apr 17；5:172；Wingfield PT.Overview of the purification ofrecombinant proteins.Curr Protoc Protein Sci.2015Apr 1；80:6.1.1-35有相關說明)。His標簽由6個組氨酸組成，分子量小、免疫原性差、不改變蛋白質的空間結構及其溶解性；利用帶鎳離子的填料進行親和純化，方法簡單、成本低、目標蛋白純度高，是目前應用最廣泛的融合表達親和標簽。pET和PQE系列質粒載體是目前最常用的His蛋白表達載體，目的基因被克隆到pET和PQE質粒載體上，受T7或T5強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；充分誘導時，細菌能高度地表達目的蛋白。然而，pET和PQE系列質粒表達系統存在三個明顯的缺陷。其一，它們在大腸桿菌中的復制效率低，基因重組費時、成本高；其二，重組的目的蛋白易漏出表達，表達有毒蛋白時會抑制細菌生長甚至殺滅細菌。其三，誘導劑IPTG的高花費和潛在的毒性阻礙這一表達系統用于生產大劑量的重組蛋白。近年開發的另一原核生物表達系統---cumate誘導表達系統(現有文獻：Choi YJ,Morel L,LeT,Bourque D,Bourget L,Groleau D,Massie B,Míguez CB.Novel,versatile,and tightly regulatedexpression system for Escherichia coli strains.Appl Environ Microbiol.2010，76(15):5058-66；Mullick A,Xu Y,Warren R,Koutroumanis M,Guilbault C,Broussau S,Malenfant F,Bourget L,Lamoureux L,Lo R,Caron AW,Pilotte A,Massie B.The cumategene-switch:a system for regulated expression in mammalian cells.BMCBiotechnol.2006，6:43有關原核生物表達系統---cumate誘導表達系統的說明)被認為優于pET和PQE系列質粒載體系統。這一系統采用結合cuo操縱子的CymR阻遏物進行調控，外源基因的表達依賴誘導劑cumate加入，由于小分子化合物Cumate水溶性好而且無毒，這一系統適用于生產大劑量的重組蛋白。然而，國內市場尚無相關的質粒載體。另外，我們測試發現依文獻構建的載體有漏出表達。因此，借鑒cumate誘導系統構建新的高拷貝高表達且無漏出表達的質粒載體將會有極大的市場價值。

發明內容