[發明專利]高拷貝高表達重組質粒的構建及其在外源基因表達中的應用有效
| 申請號： | 201810235661.0 | 申請日： | 2018-03-21 |
| 公開（公告）號： | CN108823228B | 公開（公告）日： | 2021-08-13 |
| 發明（設計）人： | 蔡春林;徐雪姣 | 申請（專利權）人： | 安徽朵能生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/66;C12P21/00 |
| 代理公司： | 合肥洪雷知識產權代理事務所(普通合伙) 34164 | 代理人： | 孫小華 |
| 地址： | 230000 安徽省合肥市高新*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 拷貝 表達 重組 質粒 構建 及其 在外 基因 中的 應用 | ||
1.高拷貝高表達重組質粒，其特征在于：
所述重組質粒由pUC ori復制啟動子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5啟動子、cym-cmt操縱子、多克隆位點和His標簽組成；
所述重組質粒的構建包括如下步驟：
SS01采用質粒pcDNA3.1(-)為模板，PCR擴增出含pUC ori復制啟動子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，
設計引物為：
pcDNA-5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTT
pcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAA
SS02基因合成由cymR基因表達盒、T5啟動子、cym-cmt操縱子和多克隆位點組成的cumate誘導表達DNA序列cymR-cuo；
SS03通過無縫連接將SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo兩片段連接環合為原核系統表達載體DN-002；
SS04以質粒pET-28a為模板，PCR擴增出含T7啟動子下游的多克隆位點以及6xHis編碼序列和T7轉錄終止序列的DNA片段M-His-T，
設計引物為：
pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGAT
pET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTC
SS05將步驟SS04中的DNA片段M-His-T和步驟SS03中的質粒DN-002用Nco I和Xho I進行雙酶切，試劑盒純化回收后用T4DNA連接酶16℃過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α，用質粒提取試劑盒提取重組質粒DN-001，如SEQ ID NO1所示。
2.如權利要求1所述的高拷貝高表達重組質粒在表達有毒蛋白中的應用。
3.如權利要求1所述的高拷貝高表達重組質粒在外源基因表達中的應用。
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