[發(fā)明專利]一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810235440.3
• 申請日: 2018-03-21
• 公開（公告）號: CN108410947A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 裴柏平;陳玲;韋平;裴建波;徐建國
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇焦點農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;A01H1/02;C12Q1/686
• 代理公司: 廈門加減專利代理事務(wù)所(普通合伙) 35234
• 代理人: 李強(qiáng)

1.一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟A、對“南粳0212”水稻進(jìn)行紋枯病菌株接種；

步驟B、選出具有抗紋枯病性狀的“南粳0212”水稻進(jìn)行自交，得到F1；

步驟C、對F1進(jìn)行紋枯病菌株接種，選出具有抗紋枯病性狀的“南粳0212”；

步驟D、提取水葫蘆基因組DNA，并用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，獲得特定酶切水葫蘆基因組DNA；

步驟E、采用花粉管通道法將步驟D獲得的酶切水葫蘆基因組DNA導(dǎo)入具有抗紋枯病性狀的“南粳0212”F1水稻中，將F1進(jìn)行育種，得到F2；

步驟F、提取F2基因組DNA，以分子標(biāo)記sh1443-1所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳檢測，如果擴(kuò)增出對應(yīng)大小的分子標(biāo)記片段，標(biāo)志著目標(biāo)基因的存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于：步驟D中，所述限制性內(nèi)切酶為NheI和XbaI。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于，所述sh1443-1所示的引物為：

sh1443-1F：5’-GCTATTAACTAACCAGCTCAT-3’;

sh1443-1R：5’-CTAGTTGGGCGCAACGATGA-3’。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于：步驟F中，對應(yīng)分子標(biāo)記片段的大小為640bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于：步驟E中，所述酶切水葫蘆基因組DNA溶液的濃度為100-200μg/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于，步驟D中，提取水葫蘆基因組DNA的方法包括：

d1、取水葫蘆種子置于45℃-70℃的烘箱中干燥4-8小時后，用粉碎機(jī)粉碎；

d2、將粉碎后的水葫蘆種子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取緩沖液混勻后，渦旋震蕩1-3min，加入1倍CTAB緩沖液，55-65℃恒浴30min；

d2、向步驟d1獲得的溶液中加入體積比為2:1-4：1的氯仿和異戊醇，混合后離心；

d3、向步驟d2獲得的上清液中用體積比為2:1-4：1的氯仿和異戊醇再抽提1 次；

d4、向步驟d3獲得的上清液中加入2.5 倍體積的冷凍異丙醇，離心，得到的沉淀用高鹽緩沖液溶解后離心；

d5、向步驟d4獲得的上清液中加入異丙醇，離心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等體積的氯仿/異戊醇抽提；

d6、取步驟d5獲得上清液加入1.0-3.0倍體積70%冷乙醇于-40℃環(huán)境中沉淀后離心；

d7、將步驟d6獲得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE緩沖液溶解，即獲得水葫蘆基因組DNA。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記輔助選擇抗紋枯病水稻的方法，其特征在于：

所述的PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：5×Taq PCR Master Mix13 .5μL，3 pmol/μl的所述分子標(biāo)記引物對1μl，2.5 mM dNTPs 0.2μl，5 U/μl的Taq 酶0.1μl，10ng/μl基因組模板DNA 1μl，加ddH₂O至總體積20μL ；

反應(yīng)程序為：DNA 95℃預(yù)變性5 min后；94℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)25次；最后72℃延10min。