[發明專利]一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法

在審

• 申請號: 201810233583.0
• 申請日: 2018-03-21
• 公開（公告）號: CN108489795A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 楊榮;郭宏騫;祝琳;顧媛媛;張群;張士偉;王鑫
• 申請（專利權）人: 上海浦美生物醫藥科技有限公司;南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N21/64;C12N5/09
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

1.一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)取100mL尿液離心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液將沉淀重懸，得到FPBS重懸的尿液細胞；

(2)將培養皿清洗后，將2wt％APTES溶液加入到培養皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，純水清洗若干次后，培養皿置于75～85℃的烘箱中烘干；

(3)將步驟(1)的FPBS重懸的尿液細胞加入到步驟(2)中的APTES培養皿中培養，之后吸除多余液體，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脫脂牛奶封閉；

(4)吸除步驟(3)的培養皿中的脫脂牛奶后，向培養皿中加入PBST清洗；

(5)向1ml 5wt％脫脂牛奶中加入2μL的anti-CK抗體和3μL的CD45抗體，混合均勻后加入到培養皿中，4℃避光孵育過夜；吸除抗體，用PBST清洗，加入1mL的DAPI，常溫避光孵育1小時；吸除抗體，用PBST清洗，再加入1mL的PBS掃描；使用GE Cytell細胞成像系統進行掃描；

(6)吸除脫脂奶粉后，在顯微鏡下進行多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色；觀察通道表面熒光顏色，顯藍色的則DAPI+，不顯藍色則DAPI-，顯綠色則CK+，不顯綠色則CK-，顯紅色則CD45+，不顯紅色則CD45-，根據熒光顯色，當DAPI+/CK+/CD45-且滿足形態學特征的為循環腫瘤細胞，然后對所有的循環腫瘤細胞計數，獲得檢驗結果。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，尿液為晨尿。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，烘干時間為1～2h。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，吸出多余液體，加入4wt％多聚甲醛1ml，4℃放置10min；吸出多余液體，加入預冷甲醇1ml，-20℃放置10min；吸出多余液體，加入2mlPBS進行洗滌；吸出多余液體，加入1mlPBS進行洗滌；吸出多余液體，加入1ml5wt％脫脂牛奶室溫封閉30min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，PBS清洗3～5次；步驟4)和步驟5)中，PBST清洗3～5次。