[發明專利]一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法

在審

• 申請號: 201810233583.0
• 申請日: 2018-03-21
• 公開（公告）號: CN108489795A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 楊榮;郭宏騫;祝琳;顧媛媛;張群;張士偉;王鑫
• 申請（專利權）人: 上海浦美生物醫藥科技有限公司;南京鼓樓醫院
• 主分類號: G01N1/40
• 分類號: G01N1/40;G01N21/64;C12N5/09
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

本發明公開了一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法。具體步驟如下：(1)制備FPBS重懸的尿液細胞；(2)將APTES加入到培養皿，避光放置、洗滌烘干；(3)將重懸的尿液細胞加入APTES培養皿中培養，再依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脫脂牛奶封閉；(4)吸除培養皿中的脫脂牛奶(5)向脫脂牛奶中加入anti?CK抗體和CD45抗體，混合均勻后加入培養皿中，避光孵育；加入DAPI，常溫避光孵育；吸除抗體，再加入PBS掃描；(6)吸除脫脂奶粉后，顯微鏡下進行多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色。本發明方法用于無創檢測膀胱癌，具有高敏感性和高特異性。

技術領域

本發明涉及一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

膀胱癌以尿路上皮癌(urothelium carcinoma，UC)最為常見，占90％以上，其中非浸潤性乳頭狀UC、原位癌及浸潤深度不超過固有層的UC統稱為淺表性UC。目前膀胱癌診斷及術后隨訪最常用的方法包括膀胱鏡、影像學檢查、尿脫落細胞學檢查、熒光原位雜交和一些尿液腫瘤標志物等。膀胱鏡是創傷性檢查，可增加患者痛苦，且禁忌癥較多；影像學檢查對病灶較小的腫瘤敏感性低，且存在一定的假陽性率；尿脫落細胞學特異性高，但對低級別UC敏感性低。除此之外，尿液腫瘤標記物也是目前研究和使用的熱點，包括端粒酶檢測、膀胱腫瘤抗原(bladder tumor antigen，BTA)、核基質蛋白、透明質酸和透明質酸酶等。膀胱癌尿脫落細胞端粒酶活性的表達與非腫瘤比較差異有統計學意義，即使在低級別的膀胱癌，端粒酶的敏感性也達到90％以上，明顯高于膀胱鏡，但端粒酶活性檢測假陽性率較高，需要進一步研究。核基質蛋白22(nuclear matrix protein 22，NMP22)是核基質蛋白家族的一員，當細胞惡變時，核內遺傳物質在分裂末期分配季度異常，NMP22合成激增，膀胱癌患者敏感性為67.6％，尿路上皮癌癥患者尿液中NMP22陽性率為61.9％，非尿路上皮癌患者尿液中陽性率為50％。但在膀胱癌術后患者的監測中，NMP22的水平易受到泌尿系統一些良性病變(如泌尿系感染、尿路結石、血尿等)的影響而增高，導致NMP22檢測結果假陽性。利用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術，能夠分析檢測標本中染色體異常改變的部分。據報道，FISH檢測膀胱癌的敏感性為29.1％，特異性為96.9％，其敏感性雖優于傳統尿細胞學，但其假陽性率較高，診斷時缺乏統一的陽性判斷標準，檢測費用亦較高，因而制約了其在臨床診斷中的使用。綜上所述，尋找一種無創、高敏感性及高特異性的檢查方法用于膀胱癌的診斷和術后隨訪是非常必要的。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法。本發明方法對于膀胱癌檢測具有無創、高敏感性和高特異性的優點。

本發明中，為盡可能多的收集尿液細胞，并且避免在熒光掃描時有細胞團或細胞簇而影響掃描計數，本發明對培養皿進行特殊處理。本發明通過用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)潤洗培養皿表面，其結構一端含有與玻璃中硅相連的烷氧基，另一端含有與細胞膜上磷脂雙分子層結合的活性基團氨基，這樣可以讓單個細胞緊密的貼合在培養皿底部。進而利用免疫熒光的方法對腫瘤細胞進行特異性標記，通過全自動熒光掃描和軟件計數，對尿液中的腫瘤細胞統計分析。

本發明的技術方案具體介紹如下。

本發明提供一種尿液腫瘤細胞富集和檢測的方法，具體步驟如下：

(1)取100mL尿液離心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液將沉淀重懸，得到FPBS重懸的尿液細胞；

(2)將培養皿清洗后，將2wt％APTES溶液加入到培養皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，純水清洗若干次后，培養皿置于75～85℃的烘箱中烘干；