[發明專利]一種條件性neuritin knockin小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 201810230101.6
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN109321595B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 楊磊;黃瑾;孫筱品;汪海燕;宋曉明;桂飛;洪玉;楊怡;諶容;朱井玲
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京國昊天誠知識產權代理有限公司 11315
• 代理人: 南霆

1.一種條件性neuritin knockin小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

PCR擴增neuritin目的基因片段；

制備CTV線性化載體；

In-Fusion無縫克隆連接；

連接產物轉化至stellar感受態細胞；

菌落PCR鑒定陽性克隆；

小量提取質粒；

質粒酶切鑒定及測序鑒定；

EndoFree Plasmid Maxi Kit大量提取測序正確的質粒并進行酶切鑒定；

單酶切使之線性化；

酚氯仿純化；

電轉導入胚胎干細胞；

PCR鑒定胚胎干細胞DNA；

將同源重組胚胎干細胞注射入囊胚；

所述菌落PCR鑒定陽性克隆的具體條件為：

1)用無菌槍頭挑取一定數量的白色菌落，接種于新LB平板上，倒置放于培養箱中，37℃培養；

2)無菌牙簽挑取單個菌落為模板至裝有PCR反應體系的離心管中，使用兩對引物分別進行PCR反應，反應引物為：

JUNLUO-F1∶5’-CACCACAAAGGAAAAAGCTGC-3’

JUNLUO-R1：5’-CAATCCGTAAGGGCTGTGAC-3’

JUNLUO-F2：5’-ACCTCAACATCCAAGGCAGC-3’

JUNLUO-R2：5’-TGAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3’

反應體系為：

PCR反應，反應體系為：

所述單酶切使之線性化的具體條件為：

水浴，反應體系如下：

所述電轉導入胚胎干細胞步驟具體為：

1)以絲裂霉素C處理的MEF細胞作feeder，培養ES細胞。ES細胞經過兩次傳代，生長至指數生長期用于Target實驗；

2)Target實驗

1.ES cell棄medium，DPBS清洗；

2.適量Trypsin-EDTA，CO2培養箱消化；

3.medium停止反應，轉移至離心管，室溫離心；

4.DPBS清洗，室溫離心，棄液體；

5.將已線性化的載體DNA與細胞液混合，靜置；

6.用滴管將混合液轉移至電轉杯；

7.伯樂電擊儀電擊，冰上靜置；

8.將電擊細胞轉移至適量ES medium分裝至含有Neo.R MEF的dish中，混勻，CO2培養；

3)G418篩選，從第二天開始，細胞每天換含有G418的新鮮medium；

4)挑克隆、凍板及陽性克隆鑒定。

2.根據權利要求1所述的條件性neuritin knockin小鼠模型的構建方法，其特征在于，PCR擴增目的片段及載體片段步驟中，以pcDNA3.1-Nrn1質粒為模板，Nrn1-F和Nrn1-R為引物進行PCR擴增Neuritin片段，同源序列通過PCR擴增引物添加。

3.根據權利要求2所述的條件性neuritin knockin小鼠模型的構建方法，其特征在于，將連接產物轉化至Stellar感受態細胞步驟，具體為：

1)取2.5μL的連接片段加入盛有50μL Steller感受態細胞的1.5mL離心管中，用移液槍將其輕柔地吹吸混勻，冰上放置30min；

2)把離心管從冰上轉移至42℃水浴鍋中，靜置45s，從水浴鍋中取出后直接放置冰上2min；

3)向離心管中加入800μL提前在37℃水浴鍋中加熱的SOC培養基；

4)將離心管固定至37℃搖床，200rpm培養約1h；

5)培養好的菌液離心，移液槍吸棄上清至剩余約300μL時，吹吸混勻菌體，吸100ul用涂布棒均勻涂布于含有100μg/mL AMP的LB固體培養基平板上；

6)涂有菌液的平板倒置放入37℃培養箱中，過夜培養。

4.根據權利要求3所述的條件性neuritin knockin小鼠模型的構建方法，其特征在于，質粒酶切鑒定的具體條件為：