[發明專利]一種提高L-羥脯胺酸產酸菌種的基因突變及菌種選育方法

在審

• 申請號: 201810227122.2
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN108330124A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 陳亮;俞洋;孫寧
• 申請（專利權）人: 安徽鼎欣醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 王桂名

本發明涉及一種提高L?羥脯胺酸產酸菌種的基因突變及菌種選育方法，包括以下步驟：1)、YPS培養基：蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；M培養基：氯化鈉5g，混勻定容至0.5L，調pH值7.0～7.1；瓊脂培養基中加入不同濃度的乙酸鈉；2)、種子培養：取25ul甘油保藏菌種，接入裝在15ml試管的5mlYPS培養基中，37℃、200rpm/min水浴搖床培養過夜，轉接0.5ml于250ml錐形瓶，33℃，200rpm/min往復式搖床培養4小時；3)、分批培養：采用磁力攪拌的微型玻璃反應器；4)、連續培養：微型玻璃反應器裝液250ml，接種量2.5ml，通氣1.5vvm，37℃，蠕動泵控制進出微型玻璃反應器的培養基流速，每隔4小時取樣測定殘糖及pH；5)、誘變；6)、經過篩選得到3株突變株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸鈉的MA培養基中培養24小時。

技術領域

本發明屬于生物化工生產領域，涉及微生物發酵的菌種基因突變及菌種選育方法，具體涉及一種提高L-羥脯胺酸產酸菌種的基因突變及菌種選育方法。

背景技術

目前，微生物發酵法生產L-羥脯胺酸還處于初級階段，尤其是菌種的產酸偏低。現有工藝菌種進行發酵法工業化生產L-羥脯胺酸的產酸偏低(產酸3～3.5％左右)，周期偏長(55～60小時)，從而導致耗能高，收率偏低的缺點。

發明內容

本發明目的是提供一種提高L-羥脯胺酸產酸菌種的基因突變及菌種選育方法，大大提高了L-羥脯胺酸的發酵產酸率、提高糖轉化率，降低生產成本。

為了實現以上目的，本發明采用的技術方案為：一種提高L-羥脯胺酸產酸菌種的基因突變及菌種選育方法，包括以下步驟：

1)、YPS培養基：蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；M培養基：氯化鈉5g，混勻定容至0.5L，調pH值7.0～7.1；瓊脂培養基中加入不同濃度的乙酸鈉；

2)、種子培養：取25ul甘油保藏菌種，接入裝在15ml試管的5mlYPS培養基中，37℃、200rpm/min水浴搖床培養過夜，轉接0.5ml于250ml錐形瓶(裝50mlYPS培養基)，33℃，200rpm/min往復式搖床培養4小時；

3)、分批培養：采用磁力攪拌的微型玻璃反應器(500ml)，裝液300ml，接種量2.5ml，通氣1.5vvm，37℃；

4)、連續培養：微型玻璃反應器裝液250ml，接種量2.5ml，通氣1.5vvm，37℃，蠕動泵控制進出微型玻璃反應器的培養基流速，每隔4小時取樣測定殘糖及pH，連續三次基本不變動時，認為達到穩定；

5)、誘變：培養過夜的大腸桿菌菌液5ml，3000rpm/min高速離心10min，加無菌生理鹽水，離心洗滌2次，均勻重懸，以不同劑量進行紫外輻射處理；輻射處理后，稀釋涂平板進行活菌計數，經過輻射處理的菌液，是變異株和出發株組成的混合體各種微生物競爭利用基質，從而具有生長優勢的微生物得以保留，不具優勢則被洗掉而淘汰，實現富集的目的；

6)、經過篩選得到3株突變株，在含10g/l葡萄糖和10g/l乙酸鈉的MA培養基中培養24小時，細胞量提高了25％，表現出明顯的生長優勢，通過在不含乙酸鈉的YPS斜面上傳代和含10g/l乙酸鈉的MA培養基中搖瓶培養，能保持其耐乙酸的特性，具有良好的穩定性。

優選的，步驟1)中

YPS培養基：稱取蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g；

M培養基：稱取氯化鈉5g，混勻定容至0.5L，調pH值7.0；

瓊脂培養基中加入不同濃度的乙酸鈉。