[發(fā)明專利]一種堆積型的嵌合抗原受體及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810225584.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108424463B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)述歡;李玉霞;高鵬;謝國(guó)明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 勝武（北京）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 南京艾普利德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 張鉑

1.一種堆積型嵌合抗原受體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）分別制備嵌合抗原受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)和非胞外抗原結(jié)合區(qū)，所述胞外抗原結(jié)合區(qū)C端氨基酸為具有炔烴基團(tuán)的非天然氨基酸，相應(yīng)的，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)N端氨基酸為具有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸，或者，所述胞外抗原結(jié)合區(qū)C端氨基酸為具有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸，相應(yīng)的，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)N端氨基酸為具有炔烴基團(tuán)的非天然氨基酸；

（2）采用點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)將步驟（1）制得的嵌合抗原受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)肽段和非胞外抗原結(jié)合區(qū)肽段通過(guò)1, 3-偶極環(huán)加成反應(yīng)偶聯(lián)，即得嵌合抗原受體，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)為嵌合抗原受體中胞外抗原結(jié)合區(qū)以外的部分。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述具有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸選自對(duì)疊氮-L-苯丙氨酸、N^ε-2-疊氮乙氧羰基-L-賴氨酸、N^ε-((1R,2R)-2-疊氮-環(huán)戊氧羰基)-L-賴氨酸、，所述具有炔烴基團(tuán)的非天然氨基酸選自N^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-賴氨酸、N^ε-戊炔-4-乙氧羰基-L-賴氨酸、N^ε-(2-丙炔基甘氨酰)-賴氨酸、、或。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述嵌合抗原受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)和非胞外抗原結(jié)合區(qū)采用人工合成或原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)過(guò)表達(dá)制備得到。

4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于采用人工合成的方法或采用M. jannaschii酪氨酸相關(guān)的正交系統(tǒng)、E. coli酪氨酸相關(guān)的正交系統(tǒng)或吡咯賴氨酸相關(guān)的正交系統(tǒng)在嵌合抗原受體的胞外抗原結(jié)合區(qū)肽段和非胞外抗原結(jié)合區(qū)插入非天然氨基酸。

5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)肽段采用如下方法制備而成：

（1）運(yùn)用分子克隆方法將正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA編碼基因及非胞外抗原結(jié)合區(qū)的含有UAG密碼子的嵌合抗原受體編碼基因克隆入質(zhì)粒pUltra的多克隆位點(diǎn)和長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)中，構(gòu)建共表達(dá)載體；

（2）將上述共表達(dá)載體與慢病毒包裝所必須的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染高效組裝慢病毒的細(xì)胞中得到具有表達(dá)重組基因的慢病毒；

（3）慢病毒介導(dǎo)具有非胞外抗原結(jié)合區(qū)的嵌合抗原受體轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞。

6.一種堆積型嵌合抗原受體，其特征在于包括胞外抗原結(jié)合區(qū)和非胞外抗原結(jié)合區(qū)，胞外抗原結(jié)合區(qū)和非胞外抗原結(jié)合區(qū)通過(guò)“點(diǎn)擊化學(xué)”的方式進(jìn)行共價(jià)連接，形成完整的嵌合抗原受體，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)肽為嵌合抗原受體中胞外抗原結(jié)合區(qū)以外的部分，所述胞外抗原結(jié)合區(qū)C端氨基酸為具有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸N^ε-2-疊氮乙氧羰基-L-賴氨酸，所述胞外抗原結(jié)合區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)N端氨基酸為具有炔烴基團(tuán)的非天然氨基酸N^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-賴氨酸，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No：4所示氨基酸序列去除信號(hào)肽的部分，胞外抗原結(jié)合區(qū)非天然氨基酸的疊氮基團(tuán)與和非胞外抗原結(jié)合區(qū)非天然氨基酸的炔烴基團(tuán)的通過(guò)1, 3-偶極環(huán)加成反應(yīng)偶聯(lián)。

7.一種嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，其特征在于表達(dá)權(quán)利要求6所述的堆積型嵌合抗原受體。

8. 一種具有多抗原靶向性的嵌合抗原受體修飾的免疫細(xì)胞，其特征在于細(xì)胞膜上具有攜有不同胞外抗原結(jié)合區(qū)的嵌合抗原受體，所述胞外抗原結(jié)合區(qū)為C端氨基酸為N^ε-2-疊氮乙氧羰基-L-賴氨酸的 Anti-CD19 scFv，氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，和C端氨基酸為N^ε-2-疊氮乙氧羰基-L-賴氨酸的Anti-Her2 scFv，氨基酸序列如SEQ ID No：13所示，所述嵌合抗原受體中胞外抗原結(jié)合區(qū)以外的部分為非胞外抗原結(jié)合區(qū)，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)肽段N端氨基酸為具有炔烴基團(tuán)的非天然氨基酸N^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-賴氨酸，所述非胞外抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No：4所示氨基酸序列去除信號(hào)肽的部分，所述Anti-CD19 scFv和Anti-Her2 scFv C端氨基酸的疊氮基團(tuán)與和非胞外抗原結(jié)合區(qū)非天然氨基酸的炔烴基團(tuán)的通過(guò)1, 3-偶極環(huán)加成反應(yīng)偶聯(lián)。