[發明專利]一種基于免疫磁分離技術和生物發光技術的大腸桿菌的檢測方法

在審

• 申請號: 201810224936.0
• 申請日: 2018-03-19
• 公開（公告）號: CN108507987A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 王春興;張志杰;楊志政;韓旭;徐元達
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張曉鵬

本發明公開了一種基于免疫磁分離技術和生物發光技術的大腸桿菌的檢測方法，包括如下步驟：1)將生物素與大腸桿菌抗體偶聯，得到生物素化的大腸桿菌抗體；2)生物素化的大腸桿菌抗體和鏈霉親和素修飾的磁性納米顆粒混合，制備磁性納米探針；3)使用PBS緩沖液沖洗磁性納米探針后，將磁性納米探針加入到大腸桿菌溶液中，使大腸桿菌被磁性納米探針捕獲；4)捕獲大腸桿菌后的溶液置于離心管中，將捕獲有大腸桿菌的磁性納米探針進行富集；5)采用清洗液對富集的樣品進行清洗，得到用于ATP發光的溶液，磁性納米探針被磁性分離架富集分離；向裂解后的溶液中加入熒光素和Mg²⁺，通過檢測溶液的熒光強度，計算得到大腸桿菌的數量。

技術領域

本發明涉及食品安全檢測領域，特別是一種基于免疫磁分離技術和ATP生物發光技術 的食品中大腸桿菌數量的檢測方法。

背景技術

目前對大腸桿菌的檢測方法包括平板稀釋法、濾膜法、熒光淬滅法等，這些檢測方法都 具有較高的靈敏度，但是都存在一定的不足，如，這些傳統方法經常需要1-3天并且需要嚴 格的實驗環境培養細菌，這就決定了這些方法無法滿足快速檢測的要求。

免疫磁分離技術是食源性致病菌快速篩查技術的重要組成部分之一，該技術可高效捕獲、 濃縮增菌液中目標菌，提高致病菌檢測靈敏度。近年來，基于磁性微珠的免疫磁分離法(IMS) 將目標菌抗體連接到磁珠上，然后將連有抗體的磁珠投入樣品液中對目標菌進行捕獲、富集， 磁分離。然而，目前該基于微米級免疫磁珠的分離技術存在磁珠捕獲效率低、需要更長的時 間去特異性捕獲食品基質中的細菌細胞、微米磁珠單分散性較差，在食品基質液中容易發生 自身聚集或形成沉淀、食品基質性質復雜并且其中非目的致病菌的雜菌濃度大，微米磁珠容 易產生非特異性吸附，難以實現對食品樣液中目的菌的特異性分離、微米磁珠的濃度過高會 造成細菌細胞的破損，導致分離的失敗、抗體與磁珠表面距離太近，磁珠本身性質及其表面 殘留的疏水或強親水基團容易引起抗體空間構象發生改變，導致抗體生物活性下降等局限。 目前，對大腸桿菌的定量檢測尚缺乏快速、準確的技術手段。

發明內容

針對上述現有技術中存在的技術問題，本發明的目的是提供一種基于免疫磁分離技術 和生物發光技術的大腸桿菌的檢測方法，這兩種技術的結合不僅提高了大腸桿菌的捕獲效 率，還提高了大腸桿菌數量的測量精度。

為了達到以上目的，本發明的技術方案為：

一種基于免疫磁分離技術和生物發光技術的大腸桿菌的檢測方法，包括如下步驟：

1)將生物素與大腸桿菌抗體偶聯，得到生物素化的大腸桿菌抗體；

2)生物素化的大腸桿菌抗體和鏈霉親和素修飾的磁性納米顆粒混合，制備磁性納米探 針；

3)使用PBS緩沖液沖洗磁性納米探針后，將磁性納米探針加入到大腸桿菌溶液中，培 養，使大腸桿菌被磁性納米探針捕獲；

4)捕獲大腸桿菌后的溶液置于離心管中，在離心管的一側放置磁性分離架，將捕獲有 大腸桿菌的磁性納米探針進行富集；

5)采用清洗液對步驟4)中富集的樣品進行清洗，得到用于ATP發光的溶液，磁性納米探針被磁性分離架富集分離；

6)向步驟5)中得到的用于ATP發光的溶液中加入ATP擦除劑設定時間后，去除溶液中體細胞和游離ATP，再加入細菌裂解劑，對大腸桿菌進行裂解；

7)向步驟6)中裂解后的溶液中加入熒光素和Mg²⁺，通過檢測溶液的熒光強度，計算得到大腸桿菌的數量。

優選的，步驟1)中，生物素與大腸桿菌抗體的摩爾比為1:1。

優選的，步驟2)中，磁性納米顆粒的粒徑為1-100nm，優選為60-80nm。

優選的，步驟3)中，培養的時間為5-15min，優選為10min。