[發(fā)明專利]環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物及檢測(cè)試劑盒與檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810222757.3
• 申請(qǐng)日: 2018-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN108179213A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王素華;吳紹強(qiáng);蔡軍;呂繼洲;帥江冰;張曉峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王素華
• 主分類號(hào): C12Q1/6893
• 分類號(hào): C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務(wù)所(普通合伙) 33237
• 代理人: 王堅(jiān)強(qiáng)

一種環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物及檢測(cè)試劑盒與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，本方法檢測(cè)非常方便快捷，并能提高檢測(cè)方法的特異性及敏感性，血液或淋巴液提取的微量病原體基因組DNA即可作為模板進(jìn)行鑒定，針對(duì)環(huán)形泰勒蟲的Tams1為靶基因的特異性區(qū)域，設(shè)計(jì)2條特異性引物，解決了現(xiàn)有PCR檢測(cè)技術(shù)低特異性和低敏感性，擴(kuò)增時(shí)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性、環(huán)形泰勒蟲含量較低時(shí)容易漏檢的缺陷，本發(fā)明方法反應(yīng)特異性更強(qiáng)、敏感性更高，該方法專用于環(huán)形泰勒蟲精準(zhǔn)檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物及檢測(cè)試劑盒與檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

環(huán)形泰勒蟲是由璃眼蜱傳播的一種牛羊寄生蟲，由其引起的疾病稱為泰勒蟲病。環(huán)形泰勒蟲主要寄生于牛羊的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞。璃眼蜱是一種二宿主蜱，它以期間傳播的方式傳播環(huán)形泰勒蟲，即幼蟲或若蟲吸食了帶蟲的血液后，泰勒蟲在蜱體內(nèi)發(fā)育繁殖，當(dāng)蜱的成蟲吸血時(shí)，即可傳播本病。病畜表現(xiàn)為高熱稽留，迅速消瘦，嚴(yán)重貧血，淋巴結(jié)腫大，淋巴結(jié)穿刺后涂片鏡檢，可在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)環(huán)形泰勒蟲裂殖體。牛羊感染環(huán)形泰勒蟲后，由于蟲體在單核巨噬系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)的反復(fù)裂體生殖和蟲體的毒素作用，病畜出現(xiàn)較為嚴(yán)重的臨床癥狀和病理變化。環(huán)形泰勒蟲的臨床診斷主要的方法是直接鏡檢、血清學(xué)診斷(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn))和常規(guī)PCR 檢測(cè)等。直接鏡檢只能用于對(duì)發(fā)病動(dòng)物的檢測(cè)，但對(duì)疫病普查和進(jìn)出口檢疫則有困難；血清學(xué)診斷也存在敏感性不高的問(wèn)題。敏感性更高的方法，例如常規(guī) PCR檢測(cè)技術(shù)也是診斷環(huán)形泰勒蟲最常用的方法，但是該方法具有很大的一個(gè)缺點(diǎn)一低特異性和低敏感性，擴(kuò)增時(shí)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR使用一對(duì)特異性引物和SYBR Green I核酸染料，精確度高，無(wú)PCR后處理步驟，避免了交叉污染，產(chǎn)出率高。SYBR Green I結(jié)合到雙鏈DNA后，熒光強(qiáng)度增加，熒光信號(hào)隨PCR進(jìn)程與不斷生成的產(chǎn)物成正比，形成熒光擴(kuò)增曲線；PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃到95℃，每升高單位溫度儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到的熔解曲線是逐漸下降的過(guò)程，且在Tm值下降最快，將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，證明反應(yīng)特異性好。SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，適用于各種病原體基因水平的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷及不足，本發(fā)明提供了了一種環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物及檢測(cè)試劑盒與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，建立一種精準(zhǔn)、高效、實(shí)用的DNA檢測(cè)方法。以環(huán)形泰勒蟲的Tams1為靶基因的特異性區(qū)域，設(shè)計(jì)2條特異性引物，提供了一種環(huán)形泰勒蟲的SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物及檢測(cè)試劑盒與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，可用于泰勒蟲病精準(zhǔn)檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊，該方法可用于泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查及快速檢測(cè)。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR特異性引物，以環(huán)形泰勒蟲的Tams1為靶基因的特異性區(qū)域，包括設(shè)計(jì)的 2條特異性引物，具體為：

Tams-F：5′-CAA-ATT-CGA-GAC-CTA-CTA-CGA-TC-3＇；

Tams-R：5′-CCA-CTT-ATC-GTC-CTT-AAG-CTC-G-3＇。

一種環(huán)形泰勒蟲SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒包括以下組分：

(一)權(quán)利要求1所述的2條特異性引物Tams-F、Tams-R；

(二)陽(yáng)性對(duì)照：所述的陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因片段的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含環(huán)形泰勒蟲1014bp基因片段；

(三)陰性對(duì)照：所述的陰性對(duì)照為去離子水；