[發明專利]環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR特異性引物及檢測試劑盒與檢測方法

在審

• 申請號: 201810222757.3
• 申請日: 2018-03-19
• 公開（公告）號: CN108179213A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王素華;吳紹強;蔡軍;呂繼洲;帥江冰;張曉峰
• 申請（專利權）人: 王素華
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙) 33237
• 代理人: 王堅強

1.一種環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR特異性引物，其特征在于，以環形泰勒蟲的Tamsl為靶基因的特異性區域，設計的2條特異性引物，具體為：

Tams-F：5′-CAA-ATT-CGA-GAC-CTA-CTA-CGA-TC-3＇；

Tams-R：5′-CCA-CTT-ATC-GTC-CTT-AAG-CTC-G-3＇。

2.一種環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的實時熒光PCR檢測試劑盒包括以下組分：

(一)權利要求1所述的2條特異性引物Tams-F、Tams-R；

(二)陽性對照：所述的陽性對照為含有目的基因片段的重組質粒，該質粒含環形泰勒蟲1014bp基因片段；

(三)陰性對照：所述的陰性對照為去離子水；

(四)含有Taq酶、dNTP、Mg²⁺和SYBR Green I的商品化SYBR預混液-Premix ExTaq^TMII(2x)；

(五)ROX Reference Dye II(50x)。

3.根據權利要求2所述的環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照通過將擴增產物克隆至pUCm-T轉化DH5-α感受態細胞，經酶切鑒定及測序后獲得為陽性重組質粒的陽性對照。

4.一種采用權利要求1所述的特異性引物的環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)被檢標本DNA提?。喝〔∨５牧馨鸵?，用商品化的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存備用。

(2)以權利要求1中的引物Tams-F和Tams-R擴增：在實時熒光PCR八連管中加入病牛淋巴液提取的DNA，同時設置陰、陽性對照，Premix Ex Taq^TMII(2x)，10μM Tams-F，10μM Tams-R，ROX Reference Dye II(50x)，DNA模板，ddH₂O于25μL反應體系中混勻后稍離心。

(3)測序：將實時熒光PCR產物送測序公司進行序列測定。

5.根據權利要求4所述的環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的實時熒光PCR反應條件為：

95℃預變性1min；

95℃保持10sec；60℃保持34sec；72℃保持30sec，該步驟進行共40個循環：

反應結束后先加熱至95℃，再降至60℃，然后以每秒1％的速度遞增至95℃

直至檢測熒光信號得出擴增產物的熔解曲線。

6.根據權利要求4所述的環形泰勒蟲SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)中SYBR Green I實時熒光PCR 25μL反應體系中，病牛淋巴液樣品基因組DNA模板量為2μL，Premix Ex Taq^TM II(2x)為12.5μL，ROX Reference Dye II為0.5μL，10μM Tams-F為1μL，0μM Tams-R為1μL，ddH₂O為8μL。