[發明專利]一種原發性多發性骨髓瘤小鼠模型構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201810211207.1
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108424933A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 胡以國;潘聰
• 申請（專利權）人: 貴州康欽承平生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A01K67/027
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙) 11670
• 代理人: 劉亞娟

本發明公開了一種原發性多發性骨髓瘤(MM)小鼠模型的構建方法及其應用，所述方法為：從MM病人樣本的測序結果中，篩選高頻突變的原癌基因作為驅動基因，構建逆轉錄病毒載體并體外感染小鼠IgM陽性B細胞，在小鼠體內誘導轉化為MM模型。篩選了10個人原癌基因組合，確定cMYC和KRAS12V為最佳。所述模型用于人MM發病機制研究、MM的化學藥物篩選、改進現有治療方案、新藥或者靶向藥物聯用的評估以及用于細胞免疫治療和抗體治療的評估。本發明構建的MM原發模型，對于科學研究MM發生發展的分子機制以及探索治療MM新靶點均具有重要意義。本發明的動物模型成模快速、100％成瘤，為開拓MM以生物治療為基礎的新靶點鑒定和新治療方法評估提供理論依據和評價系統。

技術領域

本發明涉及多發性骨髓瘤研究技術領域，具體是涉及一種原發性多發性骨髓瘤小鼠模型構建方法及其應用。

背景技術

多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一種惡性漿細胞病，其腫瘤細胞起源于骨髓中的漿細胞，而漿細胞是B淋巴細胞發育到終末階段的細胞。在中國其發病率估計為2～3/10萬，男女比例為1.6:1，大多患者年齡>50歲。目前WHO 將其歸為B細胞淋巴瘤的一種，稱為漿細胞骨髓瘤/漿細胞瘤。其特征為骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成，極少數患者可以是不產生M蛋白的未分泌型MM。多發性骨髓瘤常伴有多發性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害。

由于多發性骨髓瘤是一種高度異質性的疾病，現有的藥物和治療手段又不能夠治愈該疾病。因此，通過疾病的動物模型研究鑒定新的治療靶點或評價最新的治療手段(CAR-T細胞治療)，對于治療MM有著重要的臨床意義。

現有多發性骨髓瘤小鼠模型及其優缺點：(1)免疫缺陷鼠MM移植瘤模型：是將MM腫瘤細胞或病人組織細胞注射到小鼠體內或皮下，因其腫瘤形成速度快、勞動力要求小、成本相對較低而廣泛應用。然而皮下移植瘤并不能在腫瘤形態、微環境、轉移性和對抗癌藥物的反應等方面很好地模擬人MM發生發展的情況。同時這類模型小鼠不具備完整的免疫系統功能，不能用于評價免疫治療。(2) 致癌物誘發的小鼠MM模型：石油提取物pristane是小鼠MM最常用的致癌誘發化合物。化學誘導的小鼠MM模型不僅可用于研究MM發生的分子機制，還可用于評估和評價治療MM的化學藥物。但是小鼠的性別、年齡、品系和遺傳背景對MM 發生的影響一直是用該方法構建模型的瓶頸。(3)基因修飾性的小鼠MM模型：在研究特殊基因在MM發生過程中的作用或不同基因間的相互作用方面具有獨特優勢。隨著小鼠基因修飾技術的不斷發展，如CRISPR/Cas9的出現，為轉基因模型的構建提供了更加有力的工具。然而轉基因小鼠其造模成本高、耗時長、成瘤率不均一、不能完全模擬人類MM發生發展過程等缺點限制其用途和價值。

發明內容

針對上述存在的問題，本發明提供了一種原發性多發性骨髓瘤小鼠模型構建方法及其應用。

本發明的技術方案是：

一種原發性多發性骨髓瘤小鼠模型構建方法，從多發性骨髓瘤病人或相關疾病如MGUS樣本常規及單細胞測序結果中，并構建逆轉錄病毒載體，誘導小鼠原代細胞在小鼠體內轉化為多發性骨髓瘤原發模型。

進一步地，在上述方案中，所述的人原癌基因包括原癌基因cMYC和KRAS12V。也可以考慮是從有這個突變的病人細胞中分子克隆而來，如CCND1,FGFR3, C-MAF,MAFB,XBP1S,AKT1,BCL-XL,BCL2,HRAS12V等。(cMYC和KRAS12V是目前的第一方案)

更進一步地，所述的KRAS12V是利用點突變技術讓KRAS的第12位氨基酸突變成纈氨酸。

進一步地，在上述方案中，所述的誘導小鼠原代細胞在小鼠體內轉化為多發性骨髓瘤細胞的具體方法為：

(1)收集并純化供體鼠脾內IgM陽性淋巴細胞；