[發明專利]一種外泌體的分離方法及其分離裝置

在審

• 申請號: 201810211036.2
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108865971A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 郭秋泉;趙呈春;楊軍
• 申請（專利權）人: 深圳拓撲精膜科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12M1/12;B01D71/02;B01D67/00
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防

本發明提供了一種外泌體的及其分離裝置，是將含有外泌體的血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、腹水或者羊水首先經過濾或離心除去大于1微米的雜質，然后使用孔徑與外泌體直徑大小對應的均勻孔徑陽極氧化鋁薄膜過濾，收集濾液或均勻孔徑陽極氧化鋁薄膜上的外泌體即可得到所需的外泌體，所用的外泌體分離裝置包含使用均勻孔徑陽極氧化鋁薄膜作為濾膜的膜過濾器。本發明的分離方法及其分離裝置，能夠簡單、高效地分離外泌體，并可將不同大小的外泌體進行截取、分類，以分別對不同大小的外泌體進行相應的分析、研究和應用。

技術領域

本發明涉及一種外泌體的分離方法及其分離裝置。

背景技術

外泌體(Exosome)發現于1986年，是一種直徑約30～300nm的雙層膜囊泡狀結構小體，可由機體內多種細胞如免疫細胞、干細胞、心血管細胞、網織紅細胞、血小板、神經細胞和腫瘤細胞等主動分泌產生，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、腹水、羊水等體液中。

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(如細胞因子、生長因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質，在體內參與細胞通訊、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發生和進程密切相關。由于外泌體的特殊結構和功能，使得它具有潛在的應用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。外泌體的分離純化一直是科研工作者關注的問題，獲得高純度的外泌體對后續的研究至關重要。目前人們多采用超速離心、免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒等方法實現外泌體的提取分離：

1、超速離心法(差速離心)：是最常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超速離心法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩定(可能與轉子類型有關)，純度也受到質疑；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質量。

2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續分布的密度階層，是一種區帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13～1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。

3、超濾離心：由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質，利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效，且不影響外泌體的生物活性，是提取細胞外泌體的一種新方法。

4、磁珠免疫法：外泌體表面有其特異性標記物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

5、PEG-base沉淀法：聚乙二醇(PEG)可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多(假陽性)，顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此效果易受質疑。

6、試劑盒提取：近幾年來，市場上已出現各種商業化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。這些試劑盒不需要特殊設備，隨著產品不斷更新換代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。有些試劑盒操作簡便，不用超速離心，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體——如101bio開發的系列試劑盒，可分別針對尿液、血液、細胞上清液等多種樣品進行提取，并可進一步從外泌體中獲得想要的蛋白質或者RNA分子，方便快速，因而受到大多數人的歡迎，并且質量較高。然而，市場上各類產品純化效果良莠不齊，目前仍沒有絕對的方法或試劑盒能滿足所有要求，從各類樣品中分離到理想的外泌體。