[發(fā)明專利]白洗豬LYRM1基因CDS區(qū)的克隆方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810210974.0
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108441493A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發(fā)明（設計）人: 陳祥;苑洪霞;段志強;吳雨
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

1.一種白洗豬LYRM1基因CDS區(qū)的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：將白洗豬皮下脂肪組織RNA經(jīng)逆轉錄獲得白洗豬的cDNA，將白洗豬的cDNA經(jīng)引物PCR擴增獲得獲得LYRM1基因的CDS區(qū)序列，將擴增后產(chǎn)物膠回收后與Pucm-T載體連接，轉化進入TOP10感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，藍白斑篩選，選取白色菌落LB液體培養(yǎng)基擴培，PCR檢測驗證，質粒提取測序驗證。

2.根據(jù)權利要求1所述的白洗豬LYRM1基因CDS區(qū)的克隆方法，其特征在于：所述的引物包括上游引物F和下游引物R，其序列分別為；

上游引物F的序列：5’-ATGACAACGGCAACACGACAA-3’；

下游引物R的序列：5’-GGAAACCTCATCGTGAGACTG-3’。

3.根據(jù)權利要求1所述的白洗豬LYRM1基因CDS區(qū)的克隆方法，其特征在于：所述的PCR反應體系為：所述的PCR擴增的反應總體系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA 1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反應條件為：95℃預變性5min；{95℃變性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35個循環(huán)；72℃終延伸5min，4℃保存。

4.根據(jù)權利要求1所述的白洗豬LYRM1基因CDS區(qū)的克隆方法，其特征在于：用質量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，切膠回收目的條帶和Pucm-T載體連接；連接體系：Pucm-T載體1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA連接酶1ul，ddH₂O 1ul；將反應混合物在16℃金屬浴連接過夜；將反應產(chǎn)物連接到100ul感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后選取白色單菌落分別加入盛有AMP抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h～16h PCR檢測菌液陽性克隆，提取重組質粒測序驗證。