[發明專利]白洗豬LYRM1基因CDS區的克隆方法

在審

• 申請號: 201810210974.0
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108441493A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 陳祥;苑洪霞;段志強;吳雨
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

本發明公開了一種白洗豬LYRM1基因CDS區的克隆方法。本發明能簡單準確的獲得白洗豬LYRM1基因CDS區，為從生物信息學分析LYRM1蛋白的生物特性，為白洗豬的從分子選種培育提供理論依據。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其是一種白洗豬LYRM1基因CDS區的克隆方法

背景技術

LYRM1(LYR motif containing l)是應用抑制性差減雜交技術(SSH)篩選肥胖者與健康人群腹膜脂肪組織的差異表達基因時所篩選出的一條新基因，該基因定位于人染色體16p11.2，有4個外顯子和3個內含子，mRNA全長1589bp，開放閱讀框302-670bp，編碼122個氨基酸。邱潔等通過構建了LYRM1綠色熒光蛋白融合載體，LYRM1編碼蛋白在細胞中定位于胞核中。前期研究發現該基因高表達于肥胖者脂肪組織，可促進前體脂肪細胞的增殖、抑制前體脂肪細胞的凋亡，過表達LYRM1基因可引起成熟脂肪細胞線粒體形態結構損傷和功能障礙，同時導致成熟脂肪細胞胰島素刺激下葡萄糖攝取率的降低，朱冠忠等研究表明，LYRM1基因沉默能夠引起成熟脂肪細胞Mfn2mRNA表達水平升高，說明LYRM1基因沉默可部分影響成熟脂肪細胞線粒體形態相關基因。陳福坤等發現LYRM1基因具有抑制P19細胞凋亡的作用。寇春兆等研究表明LYRM1基因在骨骼肌細胞中過表達能破壞線粒體形態，降低骨骼肌細胞線粒體的膜電位。林寧等通過對3T3-L1脂肪細胞LYRM1的過表達研究發現其下調了線粒體的代謝關鍵酶基因的表達水平。梁慎等利用根癌農桿菌介導的T-DNA轉化方法，在西瓜枯萎病菌中亦發現了LYRM 1基因對其調控生長發育及其致病性有相關性。

發明內容

本發明的目的是：提供一種白洗豬LYRM1基因CDS區的克隆方法，它操作簡單，提取的準確性高。

本發明是這樣實現的：白洗豬LYRM1基因CDS區的克隆方法，包括以下步驟：將白洗豬皮下脂肪組織RNA經逆轉錄獲得白洗豬的cDNA，將白洗豬的cDNA經引物PCR擴增獲得獲得LYRM1基因的CDS區序列，將擴增后產物膠回收后與Pucm-T載體連接，轉化進入TOP10感受態細胞進行培養，藍白斑篩選，選取白色菌落LB液體培養基擴培，PCR檢測驗證，質粒提取測序驗證。

所述的引物包括上游引物F和下游引物R，其序列分別為；

上游引物F的序列：5’-ATGACAACGGCAACACGACAA-3’；

下游引物R的序列：5’-GGAAACCTCATCGTGAGACTG-3’。

所述的PCR反應體系為：所述的PCR擴增的反應總體系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA 1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反應條件為：95℃預變性5min；{95℃變性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35個循環；72℃終延伸5min，4℃保存。

用質量百分比為1.5％的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，切膠回收目的條帶和Pucm-T載體連接；連接體系：Pucm-T載體1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA連接酶1ul，ddH₂O 1ul；將反應混合物在16℃金屬浴連接過夜；將反應產物連接到100ul感受態細胞中，培養后選取白色單菌落分別加入盛有AMP抗性的LB液體培養基中，37℃搖床振蕩培養12h～16h PCR檢測菌液陽性克隆，提取重組質粒測序驗證。

由于采用了以上技術方案，本發明能簡單準確的獲得白洗豬LYRM1基因CDS區，為從生物信息學分析LYRM1蛋白的生物特性，為白洗豬的從分子選種培育提供理論依據。

附圖說明

圖1LYRM1基因CDS區擴增產物；

圖2LYRM1基因的菌液PCR結果；