[發明專利]檢測結核分枝桿菌γ干擾素的層析方法及試紙條制備方法

在審

• 申請號: 201810207509.1
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108490189A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 張明皓;周曉東;王銳
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞安生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于免疫學檢測技術領域，具體涉及一種檢測結核分枝桿菌γ干擾素的層析方法及試紙條的制備方法，其中，本檢測結核分枝桿菌γ干擾素的層析方法包括：陰性對照培養管、陽性對照培養管、測試培養管、熒光定量檢測試紙條和檢測器；其中，陰性對照培養管為含有抗凝血物質的培養管；陽性對照培養管為含有抗凝血物質和細胞凝集素的培養管；測試培養管為含有抗凝血物質和結核分枝桿菌特異性刺激抗原的培養管；熒光標記物為量子點微球；檢測器為熒光檢測器。本發明采用γ?干擾素體外釋放方法，特異性強，靈敏度高，操作簡單，適用于批量樣本的檢測。

技術領域

本發明涉及免疫學檢測技術領域，具體涉及一種基于量子點微球定量檢測結核分枝桿菌γ干擾素的層析方法。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所導致的慢性傳染病，是造成人類死亡人數最多的疾病之一，嚴重威脅著人類健康。當前全球1/3的人感染結核分枝桿菌，每年有800萬新發結核病患者，有300萬人死于結核病，是全世界由單一致病菌導致死亡人數最多的疾病。我國結核患者數量居全球第二位，是結核高負擔國家之一。由于結核感染后大部分發展成為無癥狀感染者，而無癥狀感染者在免疫能力低下等情況下較易發展成活動性結核。因此，結核病的早期診斷和治療將極大地影響著我國結核病預防和控制效果。

目前我國臨床診斷結核病的金標準為結核分枝桿菌培養，但由于培養時間較長(2-6周)，難以滿足臨床需求。另外，結核病還可以通過影像學、結核菌素皮膚實驗(tuberculin skin test，TST)、分子生物學等方法確認，但是這些方法存在若干缺陷，例如患者免疫功能低下導致實驗假陰性、接種卡介苗引起假陽性、實驗操作繁瑣、肺外結核病人取樣困難等，限制了其在臨床的應用。近年來，出現了一種更敏感更特異的血液檢測方法—γ-干擾素釋放實驗(Interferon-γrelease assays，IGRA)。IGRA的原理為：機體感染結核桿菌后，血液中的T淋巴細胞會在再次接觸結核桿菌特異性抗原時，產生和分泌相應的細胞因子(IFN-γ)，通過定量檢測IFN-γ的濃度判斷個體是否感染結核分支桿菌。該方法特異性高，取樣簡單，速度較快，適用于臨床應用。

目前市場上利用IGRA原理的檢測方法主要是酶聯免疫斑點測定(ELISPOT)法和酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)法兩種。ELISPOT方法在抽取病人血樣后需要進行淋巴細胞分離計數，操作復雜；ELISA方法需要制作標準曲線，操作耗時較長，且不適于單份樣本的檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于量子點微球定量檢測結核分枝桿菌γ干擾素的層析方法，將量子點微球作為熒光標記物，充分利用量子點微球的產率高、熒光強、光化學穩定性好、不易猝滅、可以接受長時間反復激發的優點，因而該檢測方法靈敏度高、特異性好、準確性強、操作簡便，適用于臨床檢測。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種熒光免疫層析方法，包括：陰性對照培養管、陽性對照培養管、測試培養管、熒光定量檢測試紙條和檢測器；其中陰性對照培養管為含有抗凝血物質的培養管；陽性對照培養管為含有抗凝血物質和細胞凝集素的培養管；測試培養管為含有抗凝血物質和結核分枝桿菌特異性刺激抗原的培養管；熒光標記物為量子點微球；檢測器為熒光檢測器。

進一步，所述熒光免疫層析方法還包括：在陰性對照培養管、測試培養管、陽性對照培養管中分別加入血樣，并使血樣與各培養管中的物質充分混合均勻后靜置，以吸取相應培養管中的上清液；將各上清液分別加入相應樣本緩沖液混合后，加入到熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，由熒光檢測器進行檢測。

進一步，所述結核分枝桿菌特異性刺激抗原為ESAT6和CFP10的獨立蛋白混合或ESAT6和CFP10的融合蛋白。

進一步，所述抗凝血物質為肝素鈉和/或肝素鋰。

進一步，所述細胞凝集素為植物凝集素和/或刀豆凝集素。