[發明專利]一種結直腸癌超早期病變檢測的試劑盒、方法及其應用

在審

• 申請號: 201810207133.4
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108179195A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 陳勇;田茹;李西蘭;田媛;余占江;陳永強
• 申請（專利權）人: 普邁德（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京恒和頓知識產權代理有限公司 11014
• 代理人: 蔡志勇

本發明涉及結直腸癌病變檢測技術，具體涉及一種結直腸癌超早期病變檢測的試劑盒、方法及其應用，所述試劑盒包括三對針對Septin9基因啟動子區域CpG島聯合檢測的特異性引物、特異性熒光探針以及特異性封閉探針；RT?PCR反應buffer；RT?PCR反應Taq酶；陰性質控品；陽性質控品以及分隔并包裝試劑瓶或管的包裝盒。本發明對結直腸癌病變的檢測方法具有特異性強、靈敏度高、受污染小、安全性能高等優點，檢測結果具有較好的準確性和重復性。可以精準的對結直腸癌是否發生病變進行判斷，提供臨床輔助診斷，對結直腸癌患者的治療和預后具有重要價值。

技術領域

本發明涉及結直腸癌超早期病變檢測技術，具體涉及一種結直腸癌超早期病變檢測的試劑盒、方法及其應用。

背景技術

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的惡性腫瘤，通常發生于結直腸黏膜上皮部位。2016年，中國醫學科學院腫瘤醫院、國家癌癥中心赫捷院士、全國腫瘤登記中心陳萬青教授報告發表了2015中國癌癥統計數據，報告顯示，我國2015年結直腸癌新發病例約37.63萬，死亡病例約19.11萬，在惡性腫瘤中位居前五。因此，降低我國結直腸癌的發病率和死亡率是刻不容緩的重大臨床科學問題。但目前我國結直腸癌的早期診斷率較低，明顯低于歐美國家。因此，普及結直腸癌早期篩查實現早診早治，是提高我國結直腸癌早期診斷率、降低結直腸癌相關死亡率的有效途徑。

早期結直腸癌的定義是指局限于結直腸黏膜層和黏膜下層的癌，也可稱之為原位癌、黏膜內癌。其中局限于黏膜層的為黏膜內癌，浸潤至黏膜下層但未侵犯固有肌層者為黏膜下癌。目前結直腸癌早期診斷金標準是纖維結直腸鏡，該檢測技術具有侵入性，并且要求完全徹底的腸道準備，隱私的暴露和鎮靜等不便之處，檢測依從性低。大便潛血試驗(FOBT)是目前臨床推薦的結直腸癌早期篩查的標準非侵入手段，然而其靈敏度較低，一般不超過50％，特異性也較低，不能實現結直腸癌的早期篩查和診斷。

近年，大量研究表明，表觀遺傳學修飾調控腫瘤相關基因的異常表達，是結直腸癌發生和發展中的主要機制之一。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學修飾方式之一，腫瘤細胞中DNA甲基化狀態異常，表現為基因組整體甲基化水平降低和特異性基因啟動子區域CpG島甲基化水平異常增高。DNA異常甲基化可以促進腫瘤相關基因的突變和異常表達，一些抑癌基因由于啟動子區的甲基化而使該基因表達缺失從而導致腫瘤的發生。已有研究報道在結直腸癌患者外周血中發現與原發腫瘤相同的DNA變異，表明DNA的甲基化在腫瘤的發生、發展和轉歸過程發揮重要的作用。

關于甲基化的實驗室檢測方法眾多，亞硫酸氫鹽修飾后測序法被認為是甲基化檢查的金標準。因為該方法能揭示單一克隆每個CpG位點的甲基化狀態，是一種可靠性及精確度很高的方法，但同時也有檢測步驟復雜、費用昂貴等缺點。目前在研究基因的甲基化狀態中應用最為廣泛主要是甲基化特異性PCR，其基本原理是用亞硫酸氫鹽處理ctDNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后針對CpG島區域序列設計高度特異性的引物對和熒光標記的探針，對所測基因進行擴增。通過擴增過程中熒光信號的釋放和采集，判斷分析結果。PCR方法有很高的敏感度，能夠檢出樣品中占比極小的甲基化DNA鏈，該方法有設計簡單、操作簡便、費用低廉的優點。

MLH1基因是結直腸癌中最早報道的異常血液基因DNA甲基化指標，此后，在結直腸癌患者的血液樣本中，檢測到不同基因啟動子的異常甲基化，如CDKN2A、ALX4、RUNX3等，其甲基化的頻率均明顯高于健康對照者。Septin9基因甲基化檢測是最早商業化并進入臨床試驗的甲基化檢測試劑盒，通過對結直腸癌和健康患者的血漿DNA進行甲基化檢測，判斷Septin9基因是否發生甲基化，從而預測是否發生結直腸癌病變。但是Septin9基因啟動子區域含有多處CpG島序列，現有的Septin9基因甲基化檢測僅以Septin9基因啟動子v2區域一處序列進行檢測，無法有效評估Septin9基因啟動子整體甲基化程度，漏檢率較高，從而造成假陰性率高，導致靈敏度較低，一般為68％左右，無法實現結直腸癌的超早期篩查。