[發明專利]一種結直腸癌超早期病變檢測的試劑盒、方法及其應用

在審

• 申請號: 201810207133.4
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108179195A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 陳勇;田茹;李西蘭;田媛;余占江;陳永強
• 申請（專利權）人: 普邁德（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京恒和頓知識產權代理有限公司 11014
• 代理人: 蔡志勇

1.一種結直腸癌超早期病變檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括三對針對Septin9基因啟動子區域CpG島聯合檢測的特異性引物、特異性熒光探針以及特異性封閉探針；RT-PCR反應buffer；RT-PCR反應Taq酶；陰性質控品；陽性質控品以及分隔并包裝試劑瓶或管的包裝盒。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物、特異性熒光探針以及特異性封閉探針的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1-15所示的片段；所述SEQ ID NO：1-4，SEQ ID NO：5-8，SEQ ID NO：9-12所示的序列分別用于檢測Septin9基因啟動子區域三處不同的CpG島甲基化程度；所述SEQ ID NO：13-15所示的序列用于檢測內對照ACTB基因，用于評估檢測過程中樣本DNA量是否滿足檢測需求。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針能特異性識別Septin9基因甲基化序列；所述特異性封閉探針能特異性識別Septin9基因非甲基化序列。

4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針和特異性封閉探針均有修飾。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針5’端至少修飾有FAM、HEX、JOE、Texas Red、Cy5基團中的一種。

6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針3’端至少修飾有BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、TAMRA基團中的一種。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性封閉探針3’端修飾有C3間臂。

8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述特異性引物濃度均為0.1～0.5μmol/L，特異性熒光探針和特異性封閉探針濃度均為0.1～0.4μmol/L。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應buffer pH值為7.5～8.5，由20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl₂和0.1～0.5mmol/L的KCl組成。

10.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應酶由熱啟動Taq酶和dNTPs組成。

11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，熱啟動Taq酶的用量為2～10U；dNTPs為2～5mmol/L。

12.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質控品為人工合成的非甲基化Septin9基因DNA，使用終濃度為0.2mM；所述陽性質控品，為甲基化的HeLa基因組DNA，使用終濃度為0.2mM。

13.一種利用如權利要求1、2、8、10中任一項所述的試劑盒用于檢測結直腸癌病變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以血漿DNA作為檢測樣本，進行亞硫酸鹽轉化；

2)取各組分混合，加入15μL轉化后的DNA樣本，進行PCR擴增反應；

3)PCR擴增：條件為95℃5分鐘；95℃15秒，60℃30秒(采集熒光)，45個循環；熒光通道選擇FAM通道和HEX通道；

4)檢測結果判定：PCR結果判定通過各檢測通道Ct值確定，在陰陽性對照均有效的情況下，內對照ACTB基因的Ct值≤40，Septin9基因的Ct值≤40，檢測結果判定為陽性；內對照ACTB基因的Ct值≤40，Septin9基因的Ct值＞40，檢測結果判定為陰性；內對照ACTB基因的Ct值＞40，Septin9基因的Ct值無論何值，檢測結果判定為無效，需重新檢測。