[發明專利]構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統和方法

有效

• 申請號: 201810201435.0
• 申請日: 2018-03-12
• 公開（公告）號: CN108410873B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 冼勛德
• 申請（專利權）人: 河北伊維沃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所 13120
• 代理人: 郝偉

本發明公開了一種構建卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)基因敲除倉鼠模型的系統和方法，所述系統包括倉鼠LCAT基因特異性打靶序列sgRNA和放大sgRNA的PCR引物。所述方法包括：設計所述倉鼠LCAT基因特異性打靶序列、制備所述cas9mRNA和sgRNA；收集和培養倉鼠受精卵；顯微注射：將所述sgRNA和cas9 mRNA共同注射至倉鼠受精卵的細胞質中；最后將顯微注射后的受精卵植入代孕倉鼠體內，F1代倉鼠出生，經鑒定構建了LCAT基因敲除的倉鼠模型。

技術領域

本發明涉及疾病動物模型及其制備技術領域，具體地，涉及一種心血管疾病動物模型及其構建方法，尤其是一種卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)基因敲除倉鼠的構建方法和系統。

背景技術

卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(Lecithin—cholesterol acyltransferase，LCAT)是催化高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)中游離膽固醇的酯化酶，并接受外周組織包括動脈壁的膽固醇，轉運到肝臟降解，是膽固醇逆轉運的關鍵因子之一。在脂蛋白代謝途徑中，LCAT對膽固醇、甘油三酯、磷脂的代謝都起到重要調節作用。人群調查研究發現，LCAT增高對冠心病有保護作用；而以小鼠為模型的研究則發現LCAT轉基因過表達可促進動脈硬化(atherosclerosis,縮寫As)，敲除LCAT反而減輕As，與LCAT在膽固醇逆轉運中的作用以及人群中的研究結果明顯相悖。因此，必須應用擬人化動物模型，才能闡明LCAT究竟是延緩還是促進冠心病的發生發展這樣一個重要科學問題。

在基因工程小鼠技術建立之后，雖然小鼠成為疾病動物模型的主要模式動物，然而科研人員越來越認識到小鼠疾病和人類疾病的區別。因此，研發和構建人源化、類人化動物模型開展轉化醫學研究，也是近年來生物醫學領域發展的一個方向。隨著近年來基因工程倉鼠的研究不斷進展，其在代謝性心血管病研究中的優勢逐步被廣泛地重新認識。和小鼠、家兔相比，倉鼠的糖脂代謝機制和人類更加相似，包括對高脂飲食的反應性，血漿脂質譜有較高的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)組分，表達膽固醇酯轉運蛋白(CETP)、HL、ApoAII，肝臟編輯ApoB100，高果糖飼料能誘導2型糖尿病，因此在代謝性心血管病研究上優勢非常明確。

基于倉鼠的類人化特點，對倉鼠的LCAT基因敲除(LCAT-/-)和轉基因，有可能為爭議中的LCAT對As的影響提供比較明確的答案，為進一步的干預方法研究提供理論基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統和方法。本發明實施例應用高效基因組編輯CRISPR/Cas9技術，構建出LCAT基因敲除的擬人化倉鼠動物模型，用于解決臨床和基礎研究中一直爭議的LCAT和動脈粥樣硬化的關系問題。

為實現上述目的，本發明實施例采用的技術方案是：

一種構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，所述系統包括倉鼠LCAT基因特異性打靶序列和sgRNA：

所述倉鼠LCAT基因特異性打靶序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA的制備：采用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列，經PCR擴增，取擴增產物中124bp的DNA片段作為sgRNA的DNA模板，所得的sgRNA的DNA模板經體外轉錄得sgRNA粗品。

可選的，所述系統還包括cas9 mRNA，其制備步驟為：采用含有人源化cas9 cDNA的PXT7質粒，經XbaI限制性內切酶作用，純化得cas9mRNA的DNA模板，所得cas9mRNA的DNA模板經體外轉錄得cas9 mRNA粗品。

可選的，所述cas9mRNA的制備中：