[發明專利]構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統和方法

有效

• 申請號: 201810201435.0
• 申請日: 2018-03-12
• 公開（公告）號: CN108410873B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 冼勛德
• 申請（專利權）人: 河北伊維沃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所 13120
• 代理人: 郝偉

1.構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，所述系統包括倉鼠LCAT基因特異性打靶序列和sgRNA：

所述倉鼠LCAT基因特異性打靶序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA的制備：采用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列，經PCR擴增，取擴增產物中124bp的DNA片段作為sgRNA的DNA模板，所得的sgRNA的DNA模板經體外轉錄得sgRNA粗品。

2.如權利要求1所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，所述系統還包括cas9 mRNA，其制備步驟為：采用含有人源化cas9 cDNA的PXT7質粒，經XbaI限制性內切酶作用，純化得cas9 mRNA的DNA模板，所得cas9 mRNA的DNA模板經體外轉錄得cas9 mRNA粗品。

3.如權利要求2所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，所述cas9mRNA的制備中：

cas9 mRNA的DNA模板純化的方法為：PXT7質粒經XbaI限制性內切酶處理后，用蛋白酶K處理20-50min，經酚-氯仿抽提，乙醇沉淀；

和/或所得cas9 mRNA粗品的純化方法為：cas9 mRNA粗品經酚-氯仿抽提、異丙醇沉淀、無RNA酶水溶解，得濃度為200-800ng/μl的cas9 mRNA。

4.如權利要求2所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，cas9 mRNA的DNA模板體外轉錄的條件為：采用mMESSAGE mMACHINE T7 kit試劑盒，在37℃反應1-3小時。

5.如權利要求1所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，所述PCR擴增的反應條件為：

98℃30s；

98℃10s,56℃30s,72℃15s，共35個循環；

72℃10min。

6.如權利要求1所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，sgRNA的DNA模板體外轉錄的條件為：采用Megascript T7 Kit試劑盒，在37℃反應3-5h。

7.如權利要求1所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的系統，其特征在于，在sgRNA的制備中，

所得sgRNA的DNA模板的選取和純化方法為：所述PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收124bp的DNA條帶，再經蛋白酶K處理20-50min，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，得sgRNA的DNA模板；和/或

所得sgRNA粗品純化的方法為：用MEGAclear Kit試劑盒進行純化，無RNase水溶解為濃度100-500ng/μl的sgRNA。

8.采用權利要求1-7任一項所述的系統構建LCAT基因敲除倉鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、設計倉鼠LCAT受體基因特異性打靶序列，如SEQ ID NO:1所示；以含有人源化cas9 cDNA的PXT7質粒制備cas9 mRNA，采用如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示人工序列經PCR反應和體外轉錄制得sgRNA；

步驟二、收集和培養倉鼠受精卵；

步驟三、顯微注射：將步驟一中所制得的sgRNA和cas9 mRNA注射至倉鼠受精卵的細胞質中；

步驟四、將顯微注射后的受精卵植入代孕倉鼠體內，F1代倉鼠出生，鑒定。

9.如權利要求8所述的構建LCAT基因敲除倉鼠模型的方法，其特征在于：步驟三中，所述sgRNA和cas9 mRNA的注射濃度分別為10ng/μl和20ng/μl。