[發明專利]一種單細胞基因組拷貝數變異的檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201810201022.2
• 申請日: 2018-03-12
• 公開（公告）號: CN108410970A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 郭弘妍;田婕;鄧莉莉;邢婉麗;程京;張怡然
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6858;C40B50/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳;趙青朵

本發明涉及生物技術領域，特別涉及組合物、試劑盒及其用途。本申請包含整套單細胞基因組拷貝數變異檢測的解決方案，包括單細胞擴增、文庫構建、高通量測序和信息分析，將基于轉座酶的文庫構建應用于單細胞測序，使用單管一步建庫的操作過程，降低了操作的繁瑣程度，避免了污染。此外，本發明還根據CNV最低檢出分辨率的要求提供了最優窗口長度，利用游程檢驗統計了CNV區域與正常區域測序數據相對覆蓋度的分布差異，在最后結果中輸出每個候選CNV的顯著性P值，有效提高檢測準確性。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種單細胞基因組拷貝數變異的快速檢測方法及試劑盒。

背景技術

單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序，可用于檢測單細胞基因組拷貝數變異(包含染色體非整倍體和染色體微擴增微缺失)，揭示細胞群中個體差異和細胞進化關系。

對于單細胞全基因組測序來說，單細胞擴增產物的文庫構建流程涉及到 DNA片段化、末端補平、腺苷化、接頭連接、PCR擴增，每個反應步驟后均需磁珠純化。隨著文庫構建技術發展，一些快速建庫方法可將末端補平和腺苷化一步完成，此步驟反應完成后可不進行磁珠純化，在一定程度上簡化了建庫流程，但整個文庫構建仍需3-4步才能完成，存在多次轉管和純化，易導致核酸損失和導致均一性較低，染色體微擴增微缺失(CNV)檢出準確性降低。

基于轉座酶的文庫構建方法越來越多的應用于高通量測序中，與傳統建庫方法相比，基于轉座酶的文庫構建方法可實現片段化、末端補平和接頭連接一步反應，反應后進行一步PCR擴增即可完成文庫構建，整個流程中需兩步純化。該方法較傳統建庫方法反應步驟有所降低，但片段化步驟后仍需進行純化，無法實現單管一步反應。此外，現有的商品化Tn5酶只能針對某一固定數值的核酸量進行酶切(如illumina Nextera試劑盒只能針對50ng，1ng～5ng分別采用不同規格的試劑盒進行建庫)。

對單細胞進行CNV檢測的數據分析流程主要步驟是將測序數據比對到參考基因組上，然后將基因組劃分成連續的窗口，對每個窗口比對上的reads 數進行標準化，最后篩選出比對上的reads數連續偏高或偏低的窗口作為候選CNV。現有技術對于窗口長度和CNV的選取常導致假陽性結果。現有技術對于窗口長度的選擇通常是針對特定的研究目的，測序數據量不同，檢出 CNV分辨率要求不同，需要的最優窗口長度也不一樣，同樣的數據使用窗口過大可能導致假陰性結果，窗口過小可能導致假陽性結果。同時在檢測CNV 過程中，由于基因組存在一些結構特殊區域(重復區域，低比對區域等)，容易檢出假陽性結果，對這些檢出的候選CNV進行顯著性評估顯得尤為重要。因此，提供一種操作簡便、成本較低、特異性強、敏感性高的單細胞基因組 CNV檢測方法具有重要的現實意義。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了組合物、試劑盒及其用途。本發明不需要借助正常樣本即可對每個窗口比對上的reads數進行標準化，使每個窗口的reads 數分布更均一，不僅可以節約成本還能簡化分析過程。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了Tn5蛋白復合物，包括Tn5蛋白和oligo，所述oligo包括 OligoA、Oligo5X和Oligo7X中的一種或兩者以上的混合物；

其中，OligoA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

Oligo5X的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

Oligo7X的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。