[發(fā)明專利]一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物篩選方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201810199601.8 | 申請(qǐng)日： | 2018-03-12 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108410942A | 公開（公告）日： | 2018-08-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張銘;黃華榮;曹歡歡;金立方 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 杭州精準(zhǔn)醫(yī)藥研究中心 |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/02 | 分類號(hào)： | C12Q1/02;C12N5/0735 |
| 代理公司： | 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市經(jīng)濟(jì)技*** | 國(guó)省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說(shuō)明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 胚胎干細(xì)胞 藥物篩選 集落 培養(yǎng)皿 傳代 細(xì)胞分化狀態(tài) 活細(xì)胞成像 結(jié)果誤差 內(nèi)涵分析 培養(yǎng)體系 細(xì)胞染色 數(shù)據(jù)處理 高效性 熒光 孔板 篩選 細(xì)胞 統(tǒng)計(jì) | ||
本發(fā)明公開了一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物篩選方法，其特征在于，包括：培養(yǎng)皿和孔板的處理，hESCs培養(yǎng)和傳代，hESCs在培養(yǎng)體系中的處理和活細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明通過(guò)建立一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物的篩選方法，通過(guò)集落面積間接反映細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)熒光面積/總集落面積反映細(xì)胞分化狀態(tài)，避免高內(nèi)涵分析前對(duì)細(xì)胞染色造成的結(jié)果誤差，并增加了藥物篩選的高效性和實(shí)用性。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物篩選方法。
背景技術(shù)
新藥的研發(fā)和安全性評(píng)價(jià)是一個(gè)時(shí)間周期長(zhǎng)且費(fèi)用昂貴的過(guò)程。目前，成功開發(fā)一種新藥需花費(fèi)12-17億美元，時(shí)間周期為8-12年。動(dòng)物模型是常用的藥物篩選方法，但動(dòng)物模型存在高費(fèi)用，低效率，不適合高通量篩選等缺點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞(Embryonic StemCells,ESCs)具有自我更新以及多向分化潛能等特點(diǎn)，因此可作為藥物篩選理想的體外模型。上個(gè)世紀(jì)90年代，歐洲替代方法驗(yàn)證中心(Europen center for the validation ofalternative method,ECVAM)以ESCs為對(duì)象對(duì)20種藥物的毒性進(jìn)行盲測(cè)，結(jié)果顯示，藥物的毒性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為78％，而強(qiáng)毒性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100％；后續(xù)的一系列的研究測(cè)試包括人ESCs證實(shí)了這一方法的可行性，從而正式批準(zhǔn)采用ESCs進(jìn)行體外藥物和化合物毒性篩選的動(dòng)物替代方法，也是目前唯一一個(gè)國(guó)際公認(rèn)的采用細(xì)胞系替代懷孕動(dòng)物進(jìn)行生殖毒性篩選的試驗(yàn)方法。
高內(nèi)涵篩選技術(shù)不但能實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的高通量篩選，而且通過(guò)對(duì)細(xì)胞圖像的獲取，實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)細(xì)胞/集落圖像的聚類和分類，借助數(shù)據(jù)軟件分析，轉(zhuǎn)換為可解釋的多維細(xì)胞數(shù)據(jù)信息。借助高內(nèi)涵方法，可高效實(shí)現(xiàn)對(duì)ESCs自我更新和定向分化有影響的藥物的大規(guī)模篩選。Desbordes等從2800多種藥物中篩選出22種對(duì)ESCs自我更新和定向分化有顯著影響的“激動(dòng)劑”和“抑制劑”。此后，Barbaric等采用相似的方法從1040中小分子庫(kù)中篩選出17種促進(jìn)ESCs分化，5種促進(jìn)ESCs存活的小分子藥物。這些研究證實(shí)了高通量藥物篩選的可行性。但這些方法也存在不足：對(duì)ESCs細(xì)胞增殖和分化分析需通過(guò)抗體分別對(duì)細(xì)胞核和相應(yīng)蛋白染色，再通過(guò)拍照、軟件分析進(jìn)行定量，這一過(guò)程不但增加了實(shí)驗(yàn)的繁瑣性，而且由于染色時(shí)間的控制差異導(dǎo)致分析結(jié)果的不一致性。
因此，建立一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物的篩選方法，可以通過(guò)集落面積間接反映細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)通過(guò)統(tǒng)計(jì)熒光面積/總集落面積反映細(xì)胞分化狀態(tài)，避免高內(nèi)涵分析前對(duì)細(xì)胞染色造成的結(jié)果誤差，并增加藥物篩選的高效性和實(shí)用性，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物篩選方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種基于高內(nèi)涵系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞藥物篩選方法，包括：
(1)培養(yǎng)皿和孔板的處理
溶解Vitronectin XF，在培養(yǎng)皿和孔板分別加入Vitronectin XF溶解液，室溫靜置不少于2h，鋪細(xì)胞前吸掉上清液，后利用Celladhere稀釋緩沖液清洗培養(yǎng)皿和孔板并晾干；
(2)hESCs培養(yǎng)和傳代
將hESCs接種于步驟(1)中經(jīng)VitronectinXF處理過(guò)的培養(yǎng)皿中，加入2-5mL含Y-27632的mTeSRTM1培養(yǎng)基，置于35-40℃的恒溫培養(yǎng)箱中；隔天更換所述含Y-27632的mTeSRTM1培養(yǎng)基，利用Accutase酶消化傳代；
(3)hESCs在培養(yǎng)體系中的處理
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