[發明專利]一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法

在審

• 申請號: 201810199601.8
• 申請日: 2018-03-12
• 公開（公告）號: CN108410942A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 張銘;黃華榮;曹歡歡;金立方
• 申請（專利權）人: 杭州精準醫藥研究中心
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/0735
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，包括：

(1)培養皿和孔板的處理

溶解Vitronectin XF，在培養皿和孔板分別加入Vitronectin XF溶解液，室溫靜置不少于2h，鋪細胞前吸掉上清液，后利用Celladhere稀釋緩沖液清洗培養皿和孔板并晾干；

(2)hESCs培養和傳代

將hESCs接種于步驟(1)中經VitronectinXF處理過的培養皿中，加入2-5mL含Y-27632的mTeSR^TM1培養基，置于35-40℃的恒溫培養箱中；隔天更換所述含Y-27632的mTeSR^TM1培養基，利用Accutase酶消化傳代；

(3)hESCs在培養體系中的處理

將步驟(2)中經所述Accutase酶消化傳代后的hESCs細胞，利用藥物篩選培養基將hESCs細胞稀釋成5-8×10³/mL，加入到步驟(1)中經Vitronectin XF處理過的孔板中的培養孔中，輕輕吹打混勻，并利用所述藥物篩選培養基進行培養；每隔2-3天更換所述藥物篩選培養基，培養5-7天；

(4)活細胞成像及數據處理

將經步驟(3)培養后的hESCs置于高內涵系統中，對hESCs進行全自動成像；

所述成像條件設置為：10倍物鏡明場，激發光為650～760nm；10倍物鏡綠色熒光，激發光為488nm，接受光為500～550nm；利用Harmony 3.5.2軟件對每孔中的不同部位進行隨機拍攝，并對hESCs集落總面積、熒光面積和數據進行統計。

2.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，步驟(2)中所述hESCs為攜帶Oct4-EGFP的轉基因hESCs。

3.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，步驟(2)中所述Y-27632的濃度為10μg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，步驟(2)中所述恒溫培養箱中CO₂含量為5％-10％。

5.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，步驟(2)中所述Accutase酶消化傳代方法為

a.收集對數生長期的hESCs，添加Accutase，于37℃，5％CO₂條件下消化5min；

b.添加mTeSR^TM1培養基輕輕吹打幾次，終止消化，轉移至離心管，12000rpm，離心5-8min；

c.添加mTeSR^TM1培養基重懸細胞，取100ul稀釋10倍，利用血球計數板計數。

6.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，步驟(3)中所述稀釋后的hESCs細胞，加入到培養孔中的體積為100-150μL。

7.根據權利要求1所述的一種基于高內涵系統的胚胎干細胞藥物篩選方法，其特征在于，所述hESCs總集落大小用于判斷hESCs存活或增殖情況；熒光面積/總集落面積的比例數據反應細胞的分化狀態。