[發(fā)明專利]一種殼聚糖酶的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810196500.5
• 申請日: 2018-03-09
• 公開（公告）號: CN108531418B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張翔;趙雙枝;陳相艷;劉孝永;張彥昊;辛雪
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/24;C12R1/085
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

本發(fā)明公開了一種殼聚糖酶的制備方法。以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)116為出發(fā)菌株，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件經(jīng)液體發(fā)酵制備出一種胞外殼聚糖酶，發(fā)酵液中殼聚糖酶酶活可達40?80U/mL，發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心，硫酸銨分級沉淀，DEAE?Sepharose Fast Flow離子交換層析，濃縮，冷凍干燥后得到固態(tài)殼聚糖酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及菌種發(fā)酵制備酶技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種殼聚糖酶 的制備方法。

背景技術(shù)

殼聚糖是由氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的堿性多 糖，具有諸多優(yōu)良特性，如增粘性、保濕性、生物相容性等，但由于 殼聚糖溶解性差，限制了其應(yīng)用范圍。其水解產(chǎn)物殼寡糖，具有良好 的溶解性，更易被生物機體吸收，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)療、保健品、化 妝品等多個領(lǐng)域均有很好的應(yīng)用。

殼聚糖的降解工藝主要有化學(xué)降解法和酶解法。酶法降解殼聚 糖，相對于目前常用的化學(xué)降解法，具有條件溫和易控、功能性寡糖 得率高、不易造成環(huán)境污染等優(yōu)勢。殼聚糖酶是一種專一性降解殼聚 糖分子間β-1,4糖苷鍵的酶，廣泛分布在細菌、真菌、放線菌等微生 物中，但由于產(chǎn)酶量及酶活性普遍較低，導(dǎo)致酶法制備殼寡糖生產(chǎn)成 本居高不下，因此難以滿足殼寡糖生產(chǎn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明就是針對上述存在的缺陷而提供一種殼聚糖酶的制備方 法。本發(fā)明以蠟狀芽孢桿菌116為出發(fā)菌株，該菌株能夠誘導(dǎo)性分泌 一種胞外殼聚糖酶，其培養(yǎng)條件經(jīng)優(yōu)化后，發(fā)酵上清液中殼聚糖酶酶 活可達40-80U/mL。以此發(fā)酵液為粗酶液，確立了殼聚糖酶的分離純 化方法，包括冷凍離心，硫酸銨分級沉淀，陰離子交換層析，經(jīng)濃縮、 冷凍干燥后得到固態(tài)殼聚糖酶。該方法相對于常用的二次層析制備方 法，具有簡單易行，成本較低的優(yōu)勢。

本發(fā)明的一種殼聚糖酶的制備方法技術(shù)方案為，采用蠟狀芽孢桿 菌116發(fā)酵后進行分離純化得到殼聚糖酶。

所述的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)116，分類命名：蠟樣芽 孢桿菌116(Bacillus cereus 116)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址：中國武漢，武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏編號是：CCTCC NO： M2017803，保藏日期是2017年12月18日。

所述的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)116斜面培養(yǎng)基(w/v)： 硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％，氯化鈉0.5％，硫酸鎂0.1％，粉末殼 聚糖1.0％，瓊脂2.0％，pH 6-7；

種子培養(yǎng)基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末殼聚糖0.5％，葡萄糖0.1％， 氯化鈉0.5％，磷酸氫二鉀0.07％，磷酸二氫鉀0.03％，酵母粉0.3％， 硫酸鎂0.05％，pH 6-7；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(w/v)：粉末殼聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸銨2.0％， 氯化鈉0.5％，磷酸氫二鉀0.07％，磷酸二氫鉀0.03％，酵母粉0.3％， 硫酸鎂0.05％，pH 6-7。

發(fā)酵溫度為30-32℃，發(fā)酵初始pH為6-7，發(fā)酵時間55-72h。

所述的分離純化步驟包括冷凍離心，硫酸銨分級沉淀，陰離子交 換層析，濃縮，干燥。

所述的冷凍離心具體為：將發(fā)酵液在4-8℃，5000-10000rpm離 心5-20min，棄去沉淀，獲得發(fā)酵上清液。

所述的硫酸銨分級沉淀具體為：向發(fā)酵上清液中緩慢加入硫酸 銨，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨飽和度達到35％，4℃靜置過夜后 6000rpm冷凍離心10min，去除雜蛋白；在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨， 使其飽和度達到90％，4℃靜置過夜后6000rpm冷凍離心10min，邊 加邊攪拌，棄去上清，將沉淀重懸于pH7.5，50mmol/L的PBS緩沖 液，把所得蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，在相同緩沖液中4℃透析24 h(定時更換緩沖液)。