[發明專利]一種殼聚糖酶的制備方法

有效

• 申請號: 201810196500.5
• 申請日: 2018-03-09
• 公開（公告）號: CN108531418B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 張翔;趙雙枝;陳相艷;劉孝永;張彥昊;辛雪
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農產品研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/24;C12R1/085
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

1.一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，采用蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)116發酵液進行分離純化得到殼聚糖酶；所述的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)116，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCC NO：M 2017803，保藏日期是2017年12月18日；

所述的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)116斜面培養基(w/v)：硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.2％，氯化鈉0.5％，硫酸鎂0.1％，粉末殼聚糖1.0％，瓊脂2.0％，pH 6-7；

種子培養基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末殼聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化鈉0.5％，磷酸氫二鉀0.07％，磷酸二氫鉀0.03％，酵母粉0.3％，硫酸鎂0.05％，pH 6-7；產酶培養基(w/v)：粉末殼聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸銨2.0％，氯化鈉0.5％，磷酸氫二鉀0.07％，磷酸二氫鉀0.03％，酵母粉0.3％，硫酸鎂0.05％，pH 6-7。

2.根據權利要求1所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，發酵溫度為30-32℃，發酵初始pH為6-7，發酵時間50-72h。

3.根據權利要求1所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述的分離純化步驟包括冷凍離心，硫酸銨分級沉淀，陰離子交換層析，濃縮，干燥。

4.根據權利要求3所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述的冷凍離心具體為：將發酵液在4-8℃，5000-10000rpm離心5-20min，棄去沉淀，獲得發酵上清液。

5.根據權利要求4所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述的硫酸銨分級沉淀具體為：向發酵上清液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液中硫酸銨飽和度達到35％，4℃靜置過夜后6000rpm冷凍離心10min，去除雜蛋白；在上清液中繼續加入硫酸銨，使其飽和度達到90％，4℃靜置過夜后6000rpm冷凍離心10min，邊加邊攪拌，棄去上清，將沉淀重懸于pH7.5，50mmol/L的PBS緩沖液，把所得蛋白質溶液轉移至透析袋中，在相同緩沖液中4℃透析24h。

6.根據權利要求5所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，所述的陰離子交換層析具體為：將透析后的樣品加入到已用PBS緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，先用3-5倍柱床體積的PBS緩沖液洗脫，再用含0-1mol/L氯化鈉的PBS緩沖液進行線性梯度洗脫，收集洗脫液，經酶活力檢測后收集有酶活組分。

7.根據權利要求6所述的一種殼聚糖酶的制備方法，其特征在于，將有酶活組分經濃縮、冷凍干燥后制得固態殼聚糖酶。