[發明專利]一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法

有效

• 申請號: 201810191708.8
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108426910B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 張春丹;蘇秀榕;葉央芳;周君;蘆晨陽
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法，通過對致病性哈維氏弧菌和非致病性哈維氏弧菌的代謝產物進行分析后，確定了用于檢測哈維氏弧菌是否具有致病性的標準。從而在基于NMR技術檢測分析致病性哈維氏弧菌特征性代謝產物的基礎上建立了本發明；解決鑒定未知哈維氏弧菌致病性與否屬性。本發明縮短了實驗周期，避免實驗動物個體敏感性差異，以及實驗動物在暫養過程中對環境的敏感，使致病性檢測更加方便、快捷。

技術領域

本發明屬于病原菌致病性鑒定技術領域，具體涉及一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法。

背景技術

哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是一種革蘭氏陰性菌、發光的海洋細菌，廣泛分布于海洋環境中，可分為致病性和非致病性兩種類型。致病性哈維氏弧菌在全世界范圍水產養殖業造成了巨大的經濟損失，在南美洲和亞洲地區尤為嚴重，它不但能引起海水魚、蝦、貝如大黃魚、石斑魚、鯛、鱸魚、文蛤、對蝦等多種水產動物的疾病，而且還能通過食物鏈引起食物中毒，是人畜共患致病菌。目前，哈維氏弧菌的檢測方法主要有生理生化方法、分子生物學及免疫診斷技術，如多重PCR檢測、基因芯片檢測等。在已報道的哈維氏弧菌檢測方法中，都集中在哈維氏弧菌的定性方面，但對哈維氏弧菌的致病性及其致病能力的強弱檢測方法則無報道。而哈維氏弧菌致病能力強弱往往是水產動物疾病是否爆發的關鍵因素，因此，急需開發哈維氏弧菌是否具有致病性的鑒定技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法，從而彌補現有技術的不足。

本發明首先提供一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的標準，所述的標準的建立方法如下：利用高分辨核磁共振譜儀采集待檢測的哈維氏弧菌的NMR代謝產物譜，采集用于代謝物的歸屬的¹H-¹H COSY、¹H-¹H TOCSY、¹H J分解譜、¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC 2D NMR譜，將所得數據建立分析數據矩陣，用SIMCA-P進行主成分分析，獲得直觀的聚類圖和載荷圖，當采集到的數據處于OPLS-DA值和和荷載圖A區間，則為非致病性弧菌；當樣品處于OPLS-DA值和和荷載圖B區間，則確定為致病性哈維氏弧菌。

本發明再一個方法提供一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法，該方法包括如下的步驟：

1)將待測哈維氏弧菌接至固體培養基上進行劃線培養，

所述的固體培養基，為海水牛肉膏蛋白胨固體培養基，其配方如下：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、2％瓊脂；

所述的培養，優選是在28℃培養24小時；

2)哈維氏弧菌代謝產物提取：

取培養好的哈維氏弧菌加入40％的乙腈水進行破碎提取，提取液離心取上清液后，在真空條件下除去上清液中的有機溶劑；經再次離心(4℃，12000r/min，10min)后，移取上清液進行抽濾至凝膠狀；再進行干凍后移至NMR核磁管中進行核磁分析；

3)采集NMR數據：

所有的NMR的譜都在298K下用配置有反相檢測低溫探頭Bruker Avance III800MHz譜儀下進行采集，對應的質子共振頻率為800.20MHz，使用標準的Noesypr1D脈沖序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一維1H NMR譜；施加50Hz強度的連續波在等待時間(RD，2s)和混合時間(tm，100ms)時進行水峰抑制。90°脈沖長度調至10s，t1設為6μs；

4)核磁共振數據處理和多元數據分析：