[發明專利]一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的方法

有效

• 申請號: 201810191708.8
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108426910B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 張春丹;蘇秀榕;葉央芳;周君;蘆晨陽
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種鑒定哈維氏弧菌是否具有致病性的標準的建立方法，其特征在于，所述的標準的建立方法如下：利用高分辨核磁共振譜儀采集待檢測的哈維氏弧菌的NMR代謝產物譜，采集用于代謝物的歸屬的¹H-¹H COSY、¹H-¹H TOCSY、¹H J分解譜、¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC 2DNMR譜，將所得數據建立分析數據矩陣，用SIMCA-P進行主成分分析，獲得直觀的聚類圖和載荷圖，當采集到的數據處于OPLS-DA值和荷載圖A區間，則為非致病性哈維氏弧菌；當樣品處于OPLS-DA值和荷載圖B區間，則確定為致病性哈維氏弧菌；

其中所有的NMR的譜都在298K下用配置有反相檢測低溫探頭Bruker Avance III800MHz譜儀下進行采集，對應的質子共振頻率為800.20MHz，使用標準的Noesypr1D脈沖序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一維1H NMR譜；施加50Hz強度的連續波在等待時間(RD，2s)和混合時間(tm，100ms)時進行水峰抑制，90°脈沖長度調至10s，t1設為6μs；

對一維氫譜進行手動相位和基線校正以及根據內標TSP定標后，用AMIX軟件對5.55-0.80區間的1H NMR譜進行分割并積分；為去除水和殘留的乙腈信號對譜峰的影響，與其相關的信號區間4.96-4.67和2.09-2.07被去除；每一個分割區間積分被歸一化到整個譜峰的積分面積以彌補樣品間體積或濃度的差異；

經歸一化后的NMR數據被導入SIMCA-P+軟件進行多變量統計分析：首先，利用主成分分析PCA，采用中心化數據處理方式，以觀測樣品的聚類情況和識別離群點；然后，采用正交化偏最小二乘法判別分析對NMR數據做進一步分析；模型的載荷圖采用MATLAB軟件繪制，在繪制載荷圖之前，先對自動規格化NMR數據進行back-transformation處理；載荷圖上的每一個點用顏色來表征，不同顏色對應于自動規格化的權重值；顏色標尺范圍為自動規格化權重的最小值和最大值；

當樣品處于OPLS-DA值和和荷載圖A區間，則為非致病性的哈維氏弧菌；當樣品處于OPLS-DA值和和荷載圖B區間，則確定為具有致病性哈維氏弧菌；

所述的代謝產物為異戊酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乙酸、蘇氨酸、乳酸、丙氨酸、腐胺、醋酸鹽、乙酰胺、N-乙酰基丙氨酸、蛋氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、琥珀酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲胺、賴氨酸、肌酸、Δ-羥賴氨酸、肉堿、甜菜堿、甘氨酸、核糖-5-磷酸、尿嘧啶、富馬酸鹽、酪氨酸、苯丙氨酸、胸腺嘧啶、胞苷、胸苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、甲酸、煙酸鹽、殘留的甲醇、氨基酸。