[發(fā)明專利]一種基于三代測(cè)序平臺(tái)的HLA基因分型方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810191663.4
• 申請(qǐng)日: 2018-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108460246B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郎娜;金杰;龔淳;楊帆;周家蓬;汪德鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京希望組生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G16B30/10
• 分類號(hào): G16B30/10;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于三代測(cè)序平臺(tái)的HLA基因分型方法，包括以下步驟：(1)對(duì)需要分型的HLA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR所得產(chǎn)物檢測(cè)合格后，進(jìn)行三代測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)；(3)將原始數(shù)據(jù)與參考基因序列進(jìn)行長(zhǎng)序列比對(duì)；(4)比對(duì)后對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行矯正；(5)分相得到單體型序列；(6)分型判斷。相比于現(xiàn)有的HLA基因分型方法，本發(fā)明的HLA分型方法對(duì)計(jì)算資源要求少、分型快、分辨率高，對(duì)臨床移植組織配型、群體遺傳學(xué)、人類學(xué)和進(jìn)化學(xué)等應(yīng)用和基礎(chǔ)研究工作具有重要價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基于三代測(cè)序平臺(tái)的HLA基因分型方法。

背景技術(shù)

人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)是人類主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibilitycomplex，MHC)的別稱。它位于人類6號(hào)染色體短臂，由一系列緊密連鎖的基因座構(gòu)成。HLA基因是人類基因組中多態(tài)性最高，迄今為止人類最復(fù)雜的遺傳系統(tǒng)之一。HLA基因編碼的蛋白具有識(shí)別自體與非體，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用。匹配上正確而又高精度的HLA型別對(duì)骨髓移植、器官移植是否成功起著決定性的作用。HLA I類(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和HLAII類(HLA-DRB1、HLA-DPB1、HLA-DQB1)在配型中扮演主要角色。此外，HLA基因的型別還與強(qiáng)直性脊椎炎、糖尿病等許多疾病密切相關(guān)。

HLA分型的分辨率可以分為以下四類：

a.2位為等位基因；

b.4位為特定HLA蛋白質(zhì)；

c.6位為特定HLA編碼序列(CDS)；

d.8位為特定的HLA基因序列包括未翻譯區(qū)和內(nèi)含子。

HLA系統(tǒng)研究從70年代到80年代末期主要是血清學(xué)研究；90年代以來(lái)，HLA進(jìn)入了分子水平研究階段。HLA分型技術(shù)同樣走過(guò)了這一歷程。建立于60年代的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于分析HLA產(chǎn)物特異性。1991年第11屆國(guó)際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，隨著測(cè)序技術(shù)的突飛猛進(jìn)，基于DNA序列的分型方法已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型方法。現(xiàn)DNA分型方法主要分為兩種：基于核酸序列識(shí)別的方法和基于序列分子構(gòu)型的方法。基于核酸序列識(shí)別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT(Sequence Based Typing，測(cè)序分型技術(shù))。其中PCR-SBT測(cè)序方法是現(xiàn)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的HLA分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

PCR-SBT方法通過(guò)PCR擴(kuò)增相應(yīng)HLA的基因區(qū)域，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)專業(yè)的軟件分型，從而得到HLA的基因型別信息。可達(dá)到四位的分辨率，并能檢測(cè)到新的等位基因。相對(duì)之前傳統(tǒng)的方法，其分辨率、準(zhǔn)確度較高，可達(dá)到4位的分辨率。然而，PCR-SBT仍存在以下技術(shù)缺陷：(1)成本高，時(shí)間相對(duì)較慢；(2)PCR-SBT分型方法主要針對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)比較集中的2、3、4號(hào)外顯子的測(cè)定來(lái)確定其基因型，而對(duì)第1、5、6、7號(hào)外顯子不進(jìn)行測(cè)序，由于HLA高度遺傳多態(tài)性，在第1、5、6、7外顯子上也有一定的多態(tài)性，因此現(xiàn)有的方法測(cè)定2-4外顯子多態(tài)性，可能引起部分等位基因無(wú)法指定，存在歧義的結(jié)果，嚴(yán)重影響臨床工作；(3)無(wú)法獲得基因全長(zhǎng)序列，對(duì)內(nèi)含子和UTR區(qū)的序列無(wú)法獲得；(4)具有一定的隨機(jī)、推斷引入的錯(cuò)誤；(5)對(duì)可變剪切位點(diǎn)的變異判別不敏感；(6)分型結(jié)果只能達(dá)到“4位分辨率”。

基于二代測(cè)序的分型方法，對(duì)HLA基因目的片段進(jìn)行捕獲或PCR擴(kuò)增，將二代測(cè)序短序列進(jìn)行拼接或組裝，根據(jù)序列間重疊和連鎖關(guān)系，構(gòu)建單體型，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行序列或SNV/Indel的判定；和數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比較，分型。相對(duì)于之前基于一代測(cè)序的PCR-SBT方法，該方法降低了成本，提高了多樣品的分型速度。二代測(cè)序易造成錯(cuò)誤比對(duì)，很難跨越重復(fù)序列，并且由于PCR造成的GC偏好往往導(dǎo)致GC富集區(qū)域的錯(cuò)誤覆蓋，影響變異檢測(cè)的準(zhǔn)確性。測(cè)序讀長(zhǎng)短，需要依賴拼接和組裝、連鎖分相等可能引入錯(cuò)誤，尤其是SNP較少的區(qū)域，很難保證分相的準(zhǔn)確性。無(wú)法獲得基因全長(zhǎng)，無(wú)法全面地揭示HLA的多態(tài)性。