[發(fā)明專利]一種基于三代測(cè)序平臺(tái)的HLA基因分型方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810191663.4
• 申請(qǐng)日: 2018-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN108460246B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郎娜;金杰;龔淳;楊帆;周家蓬;汪德鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京希望組生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G16B30/10
• 分類號(hào): G16B30/10;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

1.一種基于三代測(cè)序平臺(tái)的HLA基因分型方法，包括以下步驟：

(1)對(duì)需要分型的HLA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(2)PCR所得產(chǎn)物檢測(cè)合格后，進(jìn)行三代測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)；

(3)將原始數(shù)據(jù)與參考基因序列進(jìn)行長(zhǎng)序列比對(duì)，所述參考基因序列為IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫中的一條最長(zhǎng)序列；

(4)比對(duì)后采用如下程序?qū)y(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行矯正：

(4.1)編碼原始比對(duì)矩陣

經(jīng)過和參考序列的比對(duì)，所述HLA基因組成了由堿基構(gòu)成的特有矩陣；使用samtools軟件的tview命令，輸出文本格式的堿基與參考基因序列的比對(duì)矩陣；以參考基因的位置為橫坐標(biāo)、以i表示，以深度為縱坐標(biāo)、以j表示，矩陣組成單元以x表示；

設(shè)置初始閾值y，所述y表示默認(rèn)的錯(cuò)誤率，所述錯(cuò)誤率為測(cè)序錯(cuò)誤占總深度的比例，所述錯(cuò)誤率為10％；

每個(gè)i位置的堿基縱向的總深度為Dep_total[i]；

統(tǒng)計(jì)每個(gè)i位置對(duì)應(yīng)的所有j位置x的數(shù)量，記為Dep(x)；

(4.2)純合、雜合位點(diǎn)的可視化矯正

(4.2.1)設(shè)置初始錯(cuò)誤率閾值y，所述y為10％；

(4.2.2)確定擴(kuò)增子雜合等位型j位置及比例；

對(duì)于每個(gè)i位置，當(dāng)Dep(x)y，使用Dep(x1)代表最大深度堿基類型的深度，僅次于Dep(x1)的深度，用Dep(x2)表示，若有第三大堿基類型的深度，為Dep(x3)；

對(duì)整個(gè)擴(kuò)增子的雜合比例進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))20％時(shí)，假設(shè)其為純合子；當(dāng)Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))＝20％時(shí)，假設(shè)其為雜合二倍型別，選取SNV等位型雜合比最接近0.5的四個(gè)點(diǎn)，該四個(gè)點(diǎn)依照以下規(guī)則選取：

以δ_i衡量SNV等位型雜合比與0.5的接近程度，

δ_i＝(Dep(x1)/Dep_total[i]-0.5)²+(Dep(x2)/Dep_total[i]-0.5)²；選取δ_i最小的四個(gè)i位置；

且該四個(gè)i位置前后兩個(gè)位置的Dep(*)小于總深度的20％，否則繼續(xù)根據(jù)δ_i篩選；

根據(jù)該四個(gè)i位置確定矩陣中每個(gè)j位置的連鎖相：

(4.2.2.1)對(duì)于矩陣中四個(gè)雜合位點(diǎn)，即上述的四個(gè)i位置，第一個(gè)雜合位點(diǎn)i位置最大深度Dep(x1)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位1，第二大深度Dep(x2)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位2，確定第一個(gè)雜合位點(diǎn)的不需要矯正的j坐標(biāo)的相位；

(4.2.2.2)第二個(gè)雜合位點(diǎn)的相位根據(jù)第一個(gè)雜合位點(diǎn)的每一個(gè)j坐標(biāo)的相位情況確定：

若相位1對(duì)應(yīng)的堿基類型有80％為該i位置的最大深度Dep(x1)的堿基類型，且相位2對(duì)應(yīng)的堿基類型有80％為該i位置的第二大深度Dep(x2)的堿基類型，則最大深度Dep(x1)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位1，第二大深度Dep(x2)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位2；

若相位1對(duì)應(yīng)的堿基類型有80％為該i位置的最大深度Dep(x2)的堿基類型，且相位2對(duì)應(yīng)的堿基類型有80％為該i位置的最大深度Dep(x1)的堿基類型，則第二大深度Dep(x2)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位1，最大深度Dep(x1)的堿基類型對(duì)應(yīng)的矩陣的j位置為相位2；

若滿足以上兩個(gè)條件，則根據(jù)該方法確定其它雜合位點(diǎn)的連鎖相；若以上兩個(gè)條件不都滿足，繼續(xù)根據(jù)第三個(gè)位點(diǎn)分別和第一個(gè)雜合位點(diǎn)、第二個(gè)雜合位點(diǎn)進(jìn)行判斷；滿足(4.2.2.2)要求的雜合位點(diǎn)，共同確定連鎖相，不滿足(4.2.2.2)所述要求的雜合位點(diǎn)被作為純合位點(diǎn)；第四個(gè)i位置，依照此方法，對(duì)前面三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和對(duì)不確定相位的j位置補(bǔ)缺；

對(duì)于該四個(gè)雜合位點(diǎn)，相位1對(duì)應(yīng)的j位置組成數(shù)組j(phase1)，相位2對(duì)應(yīng)的j位置組成數(shù)組j(phase2)；以相位1對(duì)應(yīng)的基因型的深度為Dep(phase1)，以相位2對(duì)應(yīng)的基因型的深度為Dep(phase2)，計(jì)算雜合基因型的比例R_h：

R_h＝Dep(phase1)/[Dep(phase1)+Dep(phase2)]；

(4.2.3)確定純合位點(diǎn)與雜合位點(diǎn)；

對(duì)于每個(gè)i位置，滿足以下任意一種情況，則為雜合位點(diǎn)：

①Dep(x1)對(duì)應(yīng)的堿基j位置至少80％屬于數(shù)組j(phase1)，Dep(x2)對(duì)應(yīng)的堿基j位置至少80％屬于數(shù)組j(phase2)；

②Dep(x1)對(duì)應(yīng)的堿基j位置至少80％屬于數(shù)組j(phase2)，Dep(x2)對(duì)應(yīng)的堿基j位置至少80％屬于數(shù)組j(phase1)；

否則為純合位點(diǎn)；

根據(jù)矩陣中雜合位點(diǎn)j位置的連鎖相的判斷，對(duì)純合、雜合位點(diǎn)再次驗(yàn)證調(diào)整；初步確定該擴(kuò)增子或基因?yàn)榧兒蠁误w型還是雜合二倍型；

(4.2.4)堿基矯正

對(duì)于純合位點(diǎn)，該i位置調(diào)整y＝Dep(x2)；當(dāng)Dep(x)＝y(tǒng)，則該處ij坐標(biāo)的堿基被矯正為最大深度Dep(x1)的堿基類型；

對(duì)于雜合位點(diǎn)，該i位置調(diào)整y＝Dep(x3)；當(dāng)Dep(x)＝y(tǒng)，則該處ij坐標(biāo)將根據(jù)其連鎖相，從而決定該處ij坐標(biāo)的堿基被矯正為最大深度Dep(x1)的堿基或第二大深度Dep(x2)的堿基；

(4.2.5)輸出后驗(yàn)矩陣

(5)分相得到單體型序列

對(duì)矯正后的矩陣進(jìn)行序列讀取；

根據(jù)(4.2.3)確定該擴(kuò)增子為純合單體型或雜合二倍型，若為純合單體型，輸出最大深度的一條單體型序列；否則根據(jù)(4.2.3)確定的每個(gè)j位置的連鎖相，對(duì)校正后的序列按照相位1和相位2歸類；輸出最大深度的兩條單體型序列，以兩條單體型序列深度為單位，和對(duì)應(yīng)(4.2.2.2)中的Dep(phase1)、Dep(phase2)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，確定該擴(kuò)增子為純合單體型或雜合二倍型，輸出一致性序列；

(6)分型判斷

(6.1)根據(jù)比對(duì)位置，確定單體型序列的每個(gè)外顯子編號(hào)及對(duì)應(yīng)的堿基序列；對(duì)于每條單體型序列，根據(jù)外顯子匹配度輸出完全匹配結(jié)果result1，否則輸出最佳匹配的6位分型結(jié)果result1；

(6.2)進(jìn)一步對(duì)單體型全長(zhǎng)匹配打分

若IPD-IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫中基因全長(zhǎng)序列文件hla_gen.fasta，有result1的分型，則將單體型中內(nèi)含子的序列，與數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行匹配打分；

給出最佳8位分型結(jié)果result2，若突變則標(biāo)記為新的型別result2。