[發明專利]一種紅耳龜特異性引物及其應用

在審

• 申請號: 201810190950.3
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108315434A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 龔世平;萬小娟;李偉業;葛研;魏玉峰
• 申請（專利權）人: 廣東省生物資源應用研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 郝文婷;劉明星

本發明公開了一種紅耳龜特異性引物及其應用。本發明紅耳龜特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示。本發明紅耳龜特異性引物可用于PCR反應并進行電泳檢測，通過所得目的條帶的有無，快速區分紅耳龜與其它11種在中國野外有發現的龜類。本發明通過提供紅耳龜特異性引物，并建立區分紅耳龜與其它11種龜類的有效分子檢測方法，為外來入侵物種紅耳龜的快速識別提供了有效手段，該方法對實驗儀器和耗材的要求不高，對利用環境DNA調查紅耳龜野外分布提供了很好的技術支持。

技術領域

本發明屬于物種鑒定技術領域，更具體地說，本發明涉及一種用于快速區分紅耳龜與其它11種在中國野外有發現的龜類的紅耳龜特異性引物及相應的使用方法。

背景技術

紅耳龜Trachemys scripta elegans是世界最危險的100個入侵物種之一，該種目前已在歐洲、非洲和亞洲等地區成功入侵，對入侵地生態環境造成嚴重破壞，并對社會經濟與人類健康構成嚴重威脅。紅耳龜于20世紀80年代開始被引入中國，近些年來已經在中國野外廣泛分布，潛在的生態危害十分嚴重，但針對紅耳龜入侵危害的快速識技術與防控技術體系尚未建立，應急防控能力不足。在紅耳龜的野外識別方面，常見的方法是野外調查和標本采集或拍照取證，這些方法在很大程度上存在費時費力和不準確性問題，因為紅耳龜對人敏感，通常在水體中不易被直接發現，這就制約了紅耳龜野外分布快速識別工作的開展。

隨著分子生物學技術在物種野外識別方面的應用，近年來利用環境DNA(Environmental DNA)調查動物野外分布及種群密度的技術得到不斷發展，該技術可通過檢測環境樣品中某物種特異DNA片段的有無以判斷該物種是否存在，并且可以根據環境DNA濃度來推測動物種群密度，該方法可以在不采集標本或發現動物實體的條件下預測物種分布及其密度，是一種高效的動物野外調查監測技術。紅耳龜棲息于淡水環境，針對其生活習性，樣品采集主要為淡水環境(河流、池塘和湖泊等)，而中國野外同時也有其它一些淡水龜類存在，因此環境DNA可能是多種龜類DNA的混合存在。因此，開發一種紅耳龜特異性引物用于環境DNA識別技術非常必要。

在設計目標物種引物時考慮引物的特異性，同時在擴增未知模板時根據目標片段條帶的有無把目標種類與其它種類區分開來，此技術也被稱為種特異性PCR技術(species-specific PCR，ssPCR)。用于種特異性PCR技術中的基因通常有COI、D-loop及Cyt b等基因。線粒體DNA因其環狀特性不易降解，且拷貝數大于核DNA，在環境DNA技術中被應用廣泛。其中，COI基因作為目標基因被特異引物擴增時具有高敏感性，它既是目前物種鑒定中使用廣泛的分子標記之一，也是環境DNA技術中常用物種分子標記之一。

發明內容

本發明目的在于：提供了一種能快速區分紅耳龜與其它11種龜類的紅耳龜特異性引物及相應的區分方法。

為了實現上述發明目的，本發明以紅耳龜線粒體DNA中的COI基因序列為模板，采用Primer 5軟件檢查引物錯配、二聚體和發夾結構，設計了紅耳龜特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示。

本發明紅耳龜特異性引物可用于快速區分紅耳龜與其它11種在中國野外有發現的龜類。

所述其它11種在中國野外有發現的龜類包括(中文名及拉丁文名)：烏龜Mauremysreevesii、花龜Mauremys sinensis、黃喉擬水龜Mauremys mutica、安布閉殼龜Cuoraamboinensis、大鱷龜Macroclemys temminckii、蛇鱷龜Chelydra serpentina、平胸龜Platysternon megacephalum、中華鱉Pelodiscus sinensis、山瑞鱉Paleasteindachneri、亞洲鱉Amyda cartilaginea、佛羅里達鱉Apaloneferox。