[發明專利]一種3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201810190182.1
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108103037B
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 魏磊;朱秋艷;魏文天;葛永斌
• 申請（專利權）人: 亳州學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/19
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術領域；所述3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體的構建方法，包括以下步驟：1)將3?甾酮?Δ1?脫氫酶基因與表達載體連接獲得野生型重組載體；2)以獲得的野生型重組載體為模板，通過反向PCR定點突變獲得3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體重組載體；3)將獲得的3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體重組載體轉化到表達菌株獲得重組菌株，培養所述重組菌株獲得3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體。所述3?甾酮?Δ1?脫氫酶突變體比酶活為85217.08U/mg，較野生型提高了227.35％。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，尤其涉及一種3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體及其構建方法。

背景技術

甾體激素類藥物是臨床上不可缺少的一類藥物，對機體起著非常重要的調節作用，全世界對甾體激素類藥物的需求量僅次于抗生素，主要包括腎上腺皮質激素和性激素兩大類。根據其具體藥理性質，可作為麻醉藥、抗心率失常、抗細菌和真菌藥、抗膽堿酯酶藥、抗凝血劑、抗腫瘤藥、膽汁分泌劑、神經調節阻斷劑、膽石分散劑、脂調節劑、神經病治療藥、瀉藥等。目前主要以化學合成法來合成甾體激素類藥物，但由于步驟繁多、得率低、污染環境、分離純化困難，故利用微生物轉化法合成甾體藥物成為一個非常有前景的方向。微生物轉化指利用微生物的酶對甾體底物的某一部位進行特定化學反應從而獲得目標產物，如C1，2脫氫、11α-羥化、11β-羥化、C1，4脫氫、A環芳構化、C17位的不對稱還原以及甾醇側鏈的選擇性降解等。隨著現代生物技術的發展，微生物對甾體藥物的特定，高效，低耗的轉化特性受各大制藥廠青睞，并已成為研究重點，未來必將廣泛應用。

戈登氏菌(Gordonia neofelifaecis)來源的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstD)，催化甾體A環C1,2脫氫，并形成雙鍵。KstD含有1563bp長度的DNA序列，并編碼520個氨基酸，但目前野生型的3-甾酮-Δ1-脫氫酶的催化活性較低。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種催化活性高的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體及其構建方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：一種3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本發明還提供了編碼所述的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體的基因，具有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

本發明還提供了攜帶所述基因的重組載體。

本發明還提供了攜帶所述基因或上述技術方案所述重組載體的重組菌株。

本發明還提供了所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體的構建方法，包括以下步驟：1)將3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因與表達載體連接獲得野生型重組載體，所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；2)以步驟1)獲得的野生型重組載體為模板，通過反向PCR定點突變獲得上述技術方案所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體重組載體；所述反向PCR定點突變用引物為F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示；3)將步驟2)獲得的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體重組載體轉化到表達菌株獲得上述技術方案所述重組菌株，培養所述重組菌株獲得3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體。

優選的，所述反向PCR定點突變的體系包括：0.1ng/μL的野生型重組載體1μL；10pmol/μL的F307A_F 1μL；10pmol/μL的F307A_R 1μL；2×PrimeSTARMaxPremix 12.5μL；ddH₂O 9.5μL。

優選的，所述反向PCR定點突變的程序為：98℃預變性30sec；98℃變性10sec；55℃退火20sec；72℃延伸6min；30個循環后72℃再延伸10min，4℃保存。