[發明專利]一種3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體及其構建方法有效
| 申請號： | 201810190182.1 | 申請日： | 2018-03-08 |
| 公開（公告）號： | CN108103037B | 公開（公告）日： | 2020-01-21 |
| 發明（設計）人： | 魏磊;朱秋艷;魏文天;葛永斌 | 申請（專利權）人： | 亳州學院 |
| 主分類號： | C12N9/02 | 分類號： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/19 |
| 代理公司： | 11569 北京高沃律師事務所 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 236800 安徽省*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 甾酮 脫氫酶突變體 野生型 突變體重 重組菌株 重組載體 脫氫酶 構建 氨基酸序列 酶工程技術 脫氫酶基因 表達菌株 表達載體 定點突變 基因工程 載體轉化 酶活 | ||
1.一種3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.編碼權利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.攜帶權利要求2所述基因的重組載體。
4.攜帶權利要求2所述基因或權利要求3所述重組載體的重組菌株。
5.權利要求1所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體的構建方法，包括以下步驟：
1)將3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因與表達載體連接獲得野生型重組載體，所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)以步驟1)獲得的野生型重組載體為模板，通過反向PCR定點突變獲得權利要求3所述3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體重組載體；所述反向PCR定點突變用引物為F307A_F和F307A_R；所述F307A_F的序列如SEQ ID NO.6所示；所述F307A_R的序列如SEQ ID NO.7所示；
3)將步驟2)獲得的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體重組載體轉化到表達菌株獲得權利要求4所述重組菌株，培養所述重組菌株獲得3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述表達載體為pCold質粒。
7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟3)所述表達菌株為大腸桿菌BL21(DE3)。
8.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟3)所述培養后還包括以下步驟：
A)將所述培養得到的重組菌株破碎，固液分離，收集上清液；
B)將所述上清液經Ni親和層析分離純化獲得3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體。
9.權利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體或權利要求5～8任意一項所述的構建方法構建獲得的3-甾酮-Δ1-脫氫酶突變體在微生物合成甾體藥物中的應用。
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